乐果和铜、砷（Ⅲ）对费氏弧菌的联合毒性效应研究

李雪飞 黄永炳 袁孟杰 孟一鸣 徐恒蒲

摘 要：在实验室条件下，研究3种污染物质铜（Cu）、砷（As）和农药乐果（Dimethoate）对费氏弧菌（V. fischeri）的单一毒性和联合毒性效应。单一毒性实验结果表明，3种污染物质对费氏弧菌的毒性大小为Cu>As（Ⅲ）>乐果。3种物质对费氏弧菌的15min半数致死浓度（Median effective concentration，EC50）分别为2.04、5.23、523.99mg/L。利用毒性单位（Toxicity unit， TU）法、相加指数（Additive index， AI）法和混合毒性指数（Mixtures toxicity index， MTI）法对混合样本进行了定性评价，结果表明，在二元混合体系中，不同毒性单位的乐果与Cu均表现为协同作用，不同毒性单位的乐果与As（Ⅲ）部分表现为拮抗作用。乐果-Cu-As（Ⅲ）的三元混合体系的联合作用表现为部分相加作用和协同作用。

关键词：乐果；铜；砷；联合毒性；费氏弧菌

当今世界，在农业和工业生产中，重金属和有机物质被大量使用。随着诸如Cu、As等有毒重金属和农用化学品如有机农药、人工饲料和化肥先后或同时进入自然环境，并通过各种途径直接或间接进入水体，彼此产生联合作用，从而对水体环境造成复合污染[1]。发光细菌是一种能够发出可见光的细菌，利用其发光强度的变化，可以反映环境中的综合毒性[2]。发光细菌毒性检测法具有操作简单、反应迅速、结果灵敏、稳定性高等优点，故被广泛地运用到环境中污染物质的毒性检测领域。目前利用发光菌作为受试生物对重金属和有机磷农药联合毒性的研究内容涉及较少，深度较浅。而由于对重金属和有机磷农药的混合体系联合作用效应未知，导致重金属和有机磷农药的混合物已经对环境造成了严重的破坏，因此，进行重金属和有机农药的联合毒性效应研究刻不容缓。

本实验使用费氏弧菌作为受试生物，使用三种评价方法评价基于乐果和铜、砷（Ⅲ）的联合毒性效应，为环境影响评估提供基础数据。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

GloMax20/20型生物发光检测仪；高压灭菌锅；恒温培养箱；恒温振荡箱；费氏弧菌（V. fischeri）凍干粉购于北京滨松光子技术股份有限公司；乐果，有效成分含量为50%；硫酸铜（CuSO4·5H2O），分析纯；三氧化二砷（As2O3），分析纯。

1.2实验方法

1.2.1单一毒性的测定

配制不同浓度的待测液。每个浓度设置一个空白对照组和三个平行实验组，按菌液体积：待测溶液体积=1：9，测量15min后，费氏弧菌的发光强度，并计算其发光抑制率。

1.2.2联合毒性的测定

采用等毒性浓度配比法[3]，以乐果+Cu、乐果+As（Ⅲ）毒性单位比分别为1：1、1：2、2：1的比例设置质量浓度梯度，以乐果+Cu+As（Ⅲ）毒性单位比分别为1：1：1、2：1：1、1：2：1、1：1：2的比例设置浓度梯度，测定混合物对费氏弧菌的联合毒性效应。

1.3联合毒性的评价方法

1.3.1毒性单位（TU）法

式中：Ci为造成生物半致死时混合物中的i组分的浓度；EC50，i为单一受试样本i的EC50值。TUi为混合污染物中的i组分的毒性单位，TUi，max为混合物中各组分的毒性单位最大值。利用M与M0来评价联合毒性效应类型：M=1时为简单相加作用；1M0时为拮抗作用。

1.3.2相加指数（AI）法

当M≤1时，AI=1/M-1；当M>1时，AI=1-M。AI法的评价标准为：当AI=0时，为相加作用；当AI<0时，为拮抗作用；当AI>0时，为协同作用。

1.3.3混合毒性指数（MTI）法

MTI=1-lgM/lgM0

基于MTI值的评价标准为：当MTI=1时，为简单相加作用；当MTI<0时，为拮抗作用；当MTI>1时，为协同作用；当0

2 结果与讨论

作用15min时，乐果、Cu和As（Ⅲ）对费氏弧菌的EC50分别为523.99、2.04、5.23mg/L。

2.1二元联合毒性效应研究

乐果分别与Cu、As（Ⅲ）对费氏弧菌的二元联合毒性效应实验结果如表1所示。

分别使用TU法、AI法和MTI法评价受试物的联合毒性，结果如表2、表3所示。

在乐果-Cu的二元混合体系中，三种评价方法均表现为协同作用。由表2可知，随着Cu的比例的提高，M值递减，AI值递增，表明在乐果-Cu的混合体系中，Cu浓度越高，协同作用程度越大。其原因可能是乐果溶液呈弱酸性，会在一定范围内降低混合溶液的pH，故导致Cu2+的解析量增大。另外，Cu2+在混合物中所占比例大、浓度高时，会导致膜脂质过氧化，细胞膜的通透性上升[4]，利于Cu2+和乐果渗入细胞膜内产生毒害作用，使得二元毒性逐渐增强。

由表3可以得出，在乐果-As（Ⅲ）的二元混合体系中，当乐果所占比例较少时，TU法和MTI法的评价结果均为部分相加作用，而AI法的评价结果为拮抗作用；当乐果所占比例较大时，三种评价方法的结果均为拮抗作用。其原因可能是乐果溶液呈弱酸性，As（Ⅲ）在溶液中是以AsO3-3的形式存在的，当混合溶液中乐果的比例较大时，H+的浓度也较大，故此时，溶液中的AsO3-3较容易与H+结合生成较为稳定的H3AsO3，而大部分的化学物质在以稳定的化合态形式存在时的毒性小于其在以离子态形式存在时的毒性，故此时，混合溶液的毒性出现了一定程度的减弱，所以当乐果所占比例较大时，三种评价方法的结果均表现为轻微的拮抗作用。

2.2三元联合毒性效应研究

乐果-Cu-As（Ⅲ）三元混合体系联合毒性评价结果如表4、5所示。

由表5可知，在乐果-Cu- As（Ⅲ）的三元混合体系中，当混合物中Cu2+所占比例较高时，三种评价方法结果均表现为协同作用，而当混合物中Cu2+所占比例较低时，TU法与MTI法的评价结果均为部分相加作用，AI法的评价结果为拮抗作用，表明此时协同作用减弱。其原因可能是在乐果-Cu-As（Ⅲ）三元体系中，乐果与Cu表现为协同作用，乐果与As（Ⅲ）表现为拮抗作用，而乐果与Cu的协同作用程度大于乐果与As（Ⅲ）的拮抗作用程度，另外，Cu2+可以增加细胞膜的通透性，故当混合比例为1：1：1和1：2：1时，混合体系表现为协同作用。而当混合溶液中乐果和砷的比例较大时，Cu2+浓度较低，细胞膜的通透性可能会微弱上升，但并不足以使毒性物质直接进入细胞内，故此时协同作用程度较小，混合体系表现出部分相加作用，另外，当混合体系中乐果所占比例越高时，其与砷发生的拮抗作用越强，故混合体系越偏向于拮抗作用。

3 结论

（1）在单一毒性物质的作用下，15min时，乐果和Cu、As（Ⅲ）对费氏弧菌的EC50分别为523.99、2.04、5.23mg/L。毒性大小顺序依次为Cu>As（Ⅲ）>乐果。

（2）在二元联合毒性效应实验中，不同毒性单位的乐果与Cu均表现为协同作用，乐果与As（Ⅲ）表现为部分相加作用与拮抗作用。在三元联合毒性效应实验中，乐果-Cu-As（Ⅲ）表现为部分相加作用和协同作用。上述的实验结果均表明混合后毒性在大多数情况下均有一定程度的增强，在生产中需要引起重視。

（3）若混合体系中毒性物质的种类相同，但毒性配比不同，其对费氏弧菌的联合毒性作用也不完全相同，有时可能存在较大的差异。这说明在混合体系中，随着某种物质的比例发生改变，其联合作用也会随之而发生变化。

参考文献

[1]潘攀，杨俊诚，邓仕槐，等. 重金属与农药复合污染研究现状及展望[J].农业环境科学学报， 2011， 30（10）：1925-1929.

[2]Ma X Y，Wang X C， Ngo H H， et al. Bioassay based luminescent bacteria： interferences， improvements， and applications[J]. Science of the Total Environment， 2014， 468-469（Complete）：1-11.

[3]钱骁，刘瑞志， 雷坤，等. 等毒性配比法研究甲醛与重金属的联合毒性效应[J].环境污染与防治， 2014（5）.

[4]杨亚琴，贾秀英.Cu2+、Zn2+和Cd2+对蟾蜍蝌蚪的联合毒性[J].应用与环境生物学报，2006，12（3）：356-359.

作者简介

李雪飞（1993-），男，汉族，湖北咸宁，研究生在读，学士，武汉理工大学，主要研究方向：水处理。