利多卡因、乌司他丁预处理脑保护作用的实验研究

钱耀亮 刘凤芹 肖 龙

围手术期的脑保护一直以来备受麻醉医师的高度关注，手术过程中易出现脑缺血再灌注损伤，围手术期脑保护的预处理对患者的预后起到了至关重要的作用。国内外学者深入探讨了单独使用利多卡因或者乌司他丁对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响，本研究对二者联合预处理做进一步的研究，以探讨利多卡因及乌司他丁联合预处理的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠120只，体重200～250 g，动物由广东省实验动物中心提供。随机分为4组：对照组(C组)，利多卡因预处理组(L组)，乌司他丁预处理组(U组)，利多卡因与乌司他丁联合预处理组(L+U组)，全部大鼠行脑缺血再灌注。

1.2 动物模型的建立

大鼠饲养及手术室温控制于25℃左右，术前12 h禁食不禁水。大鼠给予腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉后，取仰卧位固定，备皮，碘伏消毒，取颈区正中切口，钝性分离颈部肌肉，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，于颈内动脉远心端备线，在颈总动脉分叉处剪一约0.2 mm“V”形切口，用直径约0.24 mm的尼龙线(头端粘附过多聚赖氨酸，后用肝素浸泡处理，呈锥形，头端直径约0.26～0.28 mm)，经切口插入颈内动脉约(18±1)mm，遇有轻微阻力，表明栓线穿过大脑中动脉起始端至近端，将大脑中动脉起始端阻塞结扎颈内动脉，扎紧备线并固定栓线，栓线外端留出约8 mm长，缝合皮肤。缺血2 h后，只需将栓线抽至颈内动脉起始部(拔出约10 mm)，即可恢复大脑中动脉血供，实现再灌注。L组于术前30 min予利多卡因10 mg/kg腹腔内注射，U组于术前30 min予乌司他丁20万U/kg腹腔内注射，L+U组于术前30 min予利多卡因10 mg/kg，乌司他丁20万U/kg腹腔内注射，C组于术前30 min予生理盐水2 mL腹腔内注射。

1.3 神经功能评分

再灌注后72 h从各组随机选取存活之10只大鼠，观察大鼠行为障碍的程度。采取双盲法进行评分，参考Longa等的5分制法将行为障碍进行分级评分：无神经功能缺损症状，活动正常者为0分；不能完全伸展对侧前爪者为1分；行走时出现向对侧转圈者为2分；行走时身体向对侧倒者为3分；不能自行行走，意识丧失者为4分。1～3分为建模成功。

1.4 脑梗死体积比率测定

再灌注72 h后，各组随机取4只大鼠用10%水合氯醛50 mg/kg麻醉后迅速断头取脑(除去小脑及脑干)，脑组织取出后置于-20℃低温冰箱快速(约5 min)冷冻后，由前向后取冠状面每隔2 mm切取组织片5～6片，置于2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃水浴中避光孵育20～30 min，每5 min翻动一次，待显色完全后置甲醛溶液固定一周。线粒体过氧化氢酶可氧化TTC，使存活组织呈深红色，坏死组织不着色呈苍白色。用数码相机将每片固定好脑组织片照相后，称重，并肉眼下小心挖取梗死脑组织再称重，计算出梗死区域重量及脑梗死体积比率(脑梗死体积比率=梗死区域重量/全脑重量)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析进行统计，同组间两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组缺血后神经功能评分无显著差异。再灌注72 h后，C组神经功能评分较缺血后显著升高，并显著高于3个预处理组，其余各组缺血后与再灌注72 h神经功能评分无显著差异，3个预处理组之间神经功能评分无显著差异。脑梗死区域体积及脑梗死体积比率方面，C组显著高于其他组，L组与U组之间无显著差异，L+U组分别低于L组和U组，见表1。

组别缺血后神经功能评分/分再灌注后神经功能评分/分脑梗死体积比率/%C组2.13±0.242.99±0.551)38.56±5.36L组2.17±0.522.2±0.392)27.34±3.272)U组2.08±0.352.05±0.42)26.88±4.112)L+U组2.11±0.411.98±0.362)20.83±3.022)3)

注：C组与缺血后比较，1)P<0.05；与C组比较，2)P<0.05；分别与L组和U组比较，3)P<0.05

3 讨论

在全世界范围内，脑缺血发作是致残的最常见原因。脑缺血时，由于缺氧导致细胞的能量代谢障碍和酸中毒，大脑局部的内环境稳态被打破，恢复血液供应后，脑功能不仅未能恢复，反而出现了进行性加重的损伤，这一现象称为脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-reperfusion Injury, CIRI)。本研究中C组大鼠再灌注72 h后神经功能评分显著高于缺血后，表现为典型的CIRI。CIRI是一个十分复杂的病理生理过程，主要机制包括：氧自由基过度生成，细胞内钙超载，兴奋性氨基酸的毒性作用，线粒体损伤，炎症反应及细胞凋亡等[1-4]。

脑缺血是心脏或神经外科手术的常见并发症，预防性使用神经保护药物可能对手术患者由缺血导致的脑损伤有益。利多卡因是一种局麻药和抗心律失常药，可通过血脑屏障，具有减少缺血区的跨膜离子转运，减少兴奋性毒素的释放，减慢新陈代谢，抑制炎症反应及维持脑部血流供应等特点，从而可以在围手术期提供脑保护作用[5]。韩树海等[6]通过动物实验发现利多卡因能显著促进脑缺血再灌注大鼠脑组织中热休克蛋白(HSP70)的表达，显著改善缺血后神经功能缺陷，减轻脑组织形态学损伤。提示利多卡因的脑保护作用与促进脑缺血再灌注时HSP70的表达有关。Lei B等[7]的研究表明利多卡因可减少半暗区细胞色素C的释放，抑制半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3的激活，减少DNA的断裂，在早期促进电生理学的恢复并缩小皮层梗死范围。提示利多卡因可能通过抑制半暗区细胞凋亡来达到上述脑保护作用。施贤清等[8]通过动物实验发现利多卡因预处理可使超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性升高，而使内皮素(ET)的含量降低，提示利多卡因的脑保护作用与其增加体内抗氧化物质SOD、GSH的活性及拮抗ET的毒性有关。此外，利多卡因预处理还可抑制水通道蛋白4的表达，而后者可诱发神经系统炎症反应和导致神经细胞的损伤[9]。本研究中利多卡因预处理组再灌注后神经功能评分及脑梗死体积比率均显著低于对照组，表明利多卡因预处理可有效减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤，与文献报道相一致。

乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，属蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，另具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用[10]。动物实验已经证明，乌司他丁可通过降低缺血区中性粒细胞的浸润，减小梗死体积来改善缺血再灌注损伤后的脑功能[11]。邓玉萍等[12]的研究显示乌司他丁可使脑缺血再灌注后的大鼠神经功能缺损明显改善，脑梗死体积减小，细胞凋亡数减少。其机制可能是乌司他丁增加缺血区GRP78蛋白表达，抑制CHOP和Caspase-12蛋白表达，减轻内质网应激反应，从而抑制细胞凋亡。本研究中乌司他丁预处理组的大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分及脑梗死体积比率均显著低于对照组，显示出与利多卡因预处理组相类似的脑保护作用。

利多卡因与乌司他丁脑保护的作用机理不同，二者联合应用的脑保护作用少见文献报道。本研究中L+U组虽然在再灌注后神经功能评分方面与L组和U组无显著差异，但脑梗死体积比率显著小于上两组，显示出更强的脑保护作用，为临床预防脑缺血再灌注损伤提供了新的用药思路。今后在二者联合应用提供脑保护的作用机制和用药安全方面尚需做进一步的深入探讨。

参考文献

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