基于低场核磁共振技术分析不同贮藏条件下白煮蛋水分分布及品质变化

段云霞，赵 英，迟玉杰*

鸡蛋含有丰富的营养物质，是人类饮食中重要的动物蛋白来源。白煮蛋是人们普遍喜爱的早餐食品，相比于卤蛋和腌制蛋，其能最大程度地保留鲜蛋的营养成分[1-2]。目前，丹麦的SANOVO公司开发生产了煮蛋、去壳、分装系列设备，实现了白煮蛋的工业化生产。工业化生产的白煮蛋在方便食品、航空食品、快餐行业等食品领域具有广阔的市场空间。但是白煮蛋是一种容易腐败变质的食品，在贮藏中会出现硬度增大、变色等品质问题[3]。因此，研究不同贮藏条件下白煮蛋的品质变化并探寻品质变化原因，可为延长白煮蛋的货架期提供理论依据。

低场核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术被广泛应用于食品领域，通过测定水分子的弛豫特性T2、水分的分布及其与食品组分的结合状态进而判断食品中自由水、结合水、不易流动水的移动性和分布情况[4]，有利于进一步分析水分对食品品质的影响。目前，LF-NMR技术已被广泛应用于肉制品[5-6]、果蔬[7]、面制品[8]等食品领域，在蛋制品领域的应用逐渐成熟[9-10]。刘斯琪等[11]利用NMR研究鸭蛋黄品质变化时发现，食盐会改变蛋黄内部水分迁移及分布，导致质构性质改变，进而影响蛋黄的品质。林向阳等[12]利用NMR研究室温和冷藏条件下鸡蛋腐败过程，发现鸡蛋腐败过程中，其理化性质与弛豫特性存在相关性，可通过该技术预测鸡蛋的货架期。徐雷等[13]采用LF-NMR技术研究气调贮藏过程中蛋清的水分变化，结果表明通过二氧化碳气调贮藏，可有效控制蛋清中不易流动水体积分数的上升，即抑制蛋白质结合水的能力。本实验利用LF-NMR技术研究白煮蛋在贮藏期间蛋清及蛋黄的水分分布变化，有助于深入分析白煮蛋表观品质的变化。

目前关于结合LF-NMR技术研究不同贮藏条件下白煮蛋水分分布及品质变化规律的报道甚少。基于此，本实验利用该技术研究白煮蛋在贮藏期间水分分布变化规律及品质的变化，旨在拓展此技术在蛋制品品质评价中的应用，通过探寻品质变化原因，为延长白煮蛋的贮藏期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋购于哈尔滨大润发超市；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、2-硫代巴比妥酸美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Mq-20 LF-NMR分析仪 德国布鲁克公司；MB35水分测定仪 奥豪斯仪器（常州）有限公司；TA.XT Plus型质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司；ZE-6000色差计 日本色电工业株式会社；MERLIN FE-SEM扫描电子显微镜 德国Carl Zeiss Microscopy GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 白煮蛋样品的制备

挑选质量在65～70 g左右的新鲜鸡蛋，清洗、去除表面的污染物，将所有鸡蛋在沸水中煮制10 min（水浸没全部鸡蛋），捞出后再用流动水冷却10 min。随机挑选一半数量的白煮蛋手动去壳（要求白煮蛋不破损）。将去壳和带壳的白煮蛋分别在低温（4 ℃）和室温（25 ℃）下贮藏，并对贮藏0、12、24、36、48、60 h的样品进行各指标测定。

1.3.2 水分体积分数测定

参照李运通等[8]的方法，分别称取约3 g蛋清和蛋黄样品，分割为均匀细小颗粒后置于水分测定仪托盘上，选择自动模式，测试温度为105 ℃，测试时间为30 min，测定不同贮藏时间白煮蛋样品的水分体积分数。

1.3.3 水分分布测定

参照Aursand等[14]的方法并略作修改，将白煮蛋蛋清和蛋黄切成块状放在专用的测定试管中（试管高度18 cm，直径1.8 cm），LF-NMR分析仪的磁场强度为0.47 T，质子共振频率为20 MHz。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill程序测定白煮蛋样品的横向弛豫时间T2，对于每一个样品，测定时自动扫描8 次，每次扫描重复的间隔时间为2 s。测定后的每个样品T2通过CONTIN软件进行分析，计算出相应的弛豫时间。

1.3.4 蛋白氧化测定

通过羰基含量分析蛋白氧化情况[15]。将3 g蛋清样品置于15 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，均质，离心，过滤后取0.5 mL上清液，并测定其蛋白质量浓度，之后加入0.5 mL 10%（质量分数，下同）的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液离心，沉淀部分用盐酸/丙酮溶液（3∶100，V/V）洗涤2 次。向每管中加入1 mL 10 mmol/L的DNPH溶液，空白加入1 mL 2 mol/L HCl溶液（HCl代替DNPH），室温下静置1 h（每15 min漩涡振荡1 次）。添加1 mL 20% TCA溶液，以10 000 r/min离心5 min，弃上清液，用1 mL乙酸乙酯/乙醇（1∶1，V/V）溶液洗涤沉淀3 次，除去未反应的DNPH，加3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，37 ℃条件下保温15 min溶解沉淀，10 000 r/min离心3 min除去不溶物质，最后获得物在370 nm波长处测其吸光度。羰基含量按式（1）进行计算。

式中：A370nm为最后获得物在370 nm波长处吸光度；ρ为上清液蛋白质量浓度/（mg/mL）。

1.3.5 脂肪氧化测定

采用硫代巴比妥酸产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量分析脂肪氧化情况。参考Ren Yuan等[16]的方法，略有改动。取约2 g蛋黄样品放入试管中，加入1.5 mL硫代巴比妥酸溶液，7.5 mL TCA-HCl溶液，混合后沸水浴中反应40 min，冷却至室温，取出4 mL样品溶液与等体积的氯仿混合，3 000 r/min离心10 min，532 nm波长处读取吸光度，TBARS含量按式（2）计算。

式中：A532nm为样品在532 nm波长处吸光度；m为样品质量/g；9.48为常数。

1.3.6 质构特性的测定

参照Ganasen等[17]的方法，蛋清和蛋黄分别切成20 mm×20 mm×10 mm大小的立方体，使用质构仪（25 ℃）对样品进行2 次压缩质构测定。测定参数为：探头（p36R）距样品上表面的高度为8 mm，压缩程度为50%，触发值5 g；测试前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，测试后速率2 mm/s；每个实验点平行测定6 次，选取硬度和咀嚼性作为分析指标。

1.3.7 扫描电子显微镜观察

参照Zhao Yan等[18]的方法，从蛋清上切下约4 mm×4 mm×2 mm的样品，室温下在体积分数2.5%的戊二醛（0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.8）溶液中固定过夜。随后，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）冲洗样品3 次，每次10 min。然后分别用体积分数50%、70%、80%、90%乙醇溶液进行脱水，每次10 min；再用体积分数100%乙醇脱水2 次，每次10 min。依次用V（乙醇）∶V（叔丁醇）＝1∶1和体积分数100%叔丁醇各置换1 次，每次15 min。最后将样品进行冷冻干燥。挑选截面平缓的样品粘贴在扫描电子显微镜专用的台面上，对样品表面进行喷金，用扫描电子显微镜进行扫描拍照。

1.3.8 色差值的测定方法

参照Goldner等[19]的方法，略作改动。将蛋清和蛋黄分割成大小均匀的小颗粒，平铺于比色皿中，将样品平面对准摄像装置，小孔径光束下测定样品的L*值、a*值和b*值，观察颜色变化。

1.4 数据分析

所有数据均设置3 次重复，用SPSS 19.0软件分析数据，并用Duncan法进行多重比较；采用Origin Pro 8.0软件作图。结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著。样品分3 批次进行测试，每个样品做3 个平行。

2 结果与分析

2.1 白煮蛋贮藏过程中水分体积分数的变化

水分体积分数是描述食品中水分存在的普遍参数，与食品的品质有重要关系。不同贮藏条件下白煮蛋的水分体积分数见图1。

图1 贮藏过程中白煮蛋蛋清（a）及蛋黄（b）水分体积分数变化Fig. 1 Changes in moisture contents of boiled egg white (a) and yolk (b)during storage

由图1可知，在贮藏期间所有样品的水分体积分数整体呈下降的趋势，且蛋清下降幅度显著高于蛋黄，这归因于蛋清位于白煮蛋的外层位置，在贮藏过程中，蛋清凝胶持水性下降，水分逐渐散失，随后蛋黄中的水分向外迁移，蛋黄水分体积分数也逐渐降低[17]。相比于冷藏贮藏，室温下的样品水分体积分数下降更为显著（P＜0.05），这是因为较高的温度更加有利于水分的蒸发流失。与温度相比，去壳处理是导致白煮蛋水分体积分数损失更重要的原因，与新鲜白煮蛋相比，25 ℃贮藏60 h的去壳白煮蛋蛋清及蛋黄水分体积分数分别减少了33.8%及11.5%，而相同温度和时间条件下，带壳白煮蛋蛋清及蛋黄水分体积分数分别减少了15.5%及7.1%。实验结果表明带壳低温贮藏可以维持白煮蛋的水分体积分数，很大程度上减少水分的流失，这对于维持白煮蛋的质量特性和感官品质尤为重要[20]。

2.2 白煮蛋贮藏过程中水分状态变化

为了进一步研究白煮蛋中不同形态水分的变化情况，采用LF-NMR技术获得样品弛豫时间T2图谱。T2b（1～10 ms）代表结合水，主要通过化学作用力结合到蛋白质分子上；T21和T22（10～100 ms）代表不易流动水，是指被束缚在凝胶致密的空间网络结构内部的水；T23（100～1 000 ms）代表自由水，是在凝胶空间网络结构外部可以自由移动的水。弛豫峰面积百分数（A22和A23）可以反映各种状态水分的体积分数[11]：A22代表不易流动水的弛豫峰面积，A23代表自由水的弛豫峰面积。以新鲜白煮蛋为对照组，贮藏60 h的蛋清及蛋黄水分状态变化分析如下。

图2 贮藏60 h白煮蛋蛋清横向弛豫时间T2变化Fig. 2 Changes in relation time T2 of boiled egg white after storage for 60 h

表1 贮藏60 h白煮蛋蛋清横向弛豫时间及峰面积Table 1 Relaxation time and peak area of boiled egg white after storage for 60 h

如图2所示，蛋清的T2弛豫图谱主要呈现2 个分布峰T22和T23，表明白煮蛋蛋清中水分分布包括不易流动水和自由水，其中T22为主峰，即不易流动水为主要形态。结合表1结果分析可知，与对照组相比，贮藏60 h后的4 组样品的T22分布峰均出现左移，T22及A22数值均显著变小（P＜0.05），表明贮藏后白煮蛋蛋清不易流动水体积分数变小，分析原因可能是蛋清在贮藏过程中，蛋白质发生氧化导致凝胶结构的作用力发生变化，特别是蛋白与水的作用，作用力的变化进而引起了白煮蛋吸附水、包裹水等持水能力减弱，最后导致蛋清不易流动水体积分数减少[21]。对于4 组样品，不易流动水变化程度依次为4 ℃带壳＜25 ℃带壳＜4 ℃去壳＜25 ℃去壳，这与样品蛋白氧化结果相符。李学鹏等[22]研究蛋白质氧化对肌原纤维蛋白凝胶的影响，得到氧化后蛋白凝胶不易流动水减少、凝胶持水力下降的结论，这与本研究实验结论相似。同时，贮藏期间4 组样品自由水的变化情况与不易流动水变化趋势相似，但其变化程度取决于水分的蒸发速率，4 ℃带壳贮藏可以减缓水分的流失速率，减少自由水的损失。

图3 贮藏60 h白煮蛋蛋黄横向弛豫时间T2变化Fig. 3 Changes in relation time T2 of boiled egg yolk after storage for 60 h

表2 贮藏60 h白煮蛋蛋黄横向弛豫时间及峰面积Table 2 Relaxation time and peak area of boiled egg yolk after storage for 60 h

由图3可知，蛋黄的水分分布情况不同于蛋清，T2弛豫图谱呈现4 个分布峰，即T2b（1～10 ms）结合水，T21、T22（10～100 ms）不易流动水，T23（100～1 000 ms）自由水；其中弛豫峰面积百分数（A2b、A21、A22、A23）分别反映各种状态水分的体积分数，A2b代表结合水弛豫峰面积，A21和A22代表不易流动水弛豫峰面积，A23代表自由水弛豫峰面积。结合表2结果分析可知，与对照组相比，贮藏60 h后的4 组样品的T2b及T23无显著变化，表明贮藏中蛋黄结合水与自由水无显著变化。与蛋清变化相似，4 组样品的T21及T22分布峰均出现左移，T21及T22、A21及A22数值均变小，表明贮藏后白煮蛋蛋黄的不易流动水体积分数变小，这可能归因于两方面：一方面是贮藏过程中蛋白及脂肪的氧化，破坏原有蛋黄的结构，使得蛋黄不易流动水减少，李银等[23]研究表明氧化使肉类蛋白凝胶性下降，将不易流动水“态变”为自由水，导致凝胶持水力降低；另一方面，可能是蛋清水分体积分数减少，使得蛋黄中的水分向外迁移[17]。

2.3 白煮蛋贮藏过程中氧化程度的变化

蛋白质的侧链上带有含—NH或—NH2的氨基酸，对自由基十分敏感，这些基团容易被转化成羰基基团[15]，因此羰基含量的变化能够反映蛋白质氧化程度。不同蛋清样品的羰基含量变化如图4a所示。不饱和脂肪酸的氧化产物丙二醛与硫代巴比妥酸反应后的产物，可代表脂肪氧化的程度[24]，蛋黄样品的TBARS含量变化如图4b所示。

由图4a可知，随着贮藏时间的延长，蛋清羰基含量均逐渐增加，表明蛋白质氧化程度随贮藏时间延长而升高，去壳白煮蛋的羰基含量显著高于带壳白煮蛋，表明带壳有助于延缓蛋白质氧化，这是由于蛋壳的存在可以减少蛋清与空气中氧的接触，降低氧化程度；同时低温对于蛋白质氧化也有明显的抑制作用，这是因为低温可以降低氧化反应速率。

图4 贮藏过程中白煮蛋氧化程度变化Fig. 4 Changes in oxidation degree of boiled eggs during storage

由于脂肪中含有不饱和双键，极易被氧化。从图4b可知，随着贮藏时间的延长，4 组蛋黄样品TBARS含量的变化趋势与蛋白羰基含量变化趋势相同，贮藏24 h后，蛋黄的TBARS含量存在显著性的升高趋势（P＜0.05），表明在贮藏24 h后蛋黄脂肪发生氧化并产生低分子产物。对比发现，去壳白煮蛋的TBARS含量显著高于带壳白煮蛋，这表明带壳有助于延缓脂肪氧化，原因是由于带壳包装下的不透氧环境对氧气的阻隔性能好，样品与氧气的接触少，脂肪氧化缓慢。王真真[25]采用冰温气调包装减缓了大黄鱼贮藏期间的脂肪氧化，对于去壳白煮蛋，增加额外的包装可以延缓脂肪氧化。

2.4 白煮蛋贮藏过程中质构特性的变化

白煮蛋的硬度和咀嚼性是反映其感官品质的重要指标，一般来讲，这两个指标数值越大，白煮蛋吃起来就越硬，缺乏弹性，使人们失去食欲。不同贮藏条件下白煮蛋的硬度和咀嚼性结果见图5。随贮藏时间的延长，白煮蛋蛋清和蛋黄的硬度及咀嚼性整体均呈上升趋势，表明贮藏期间白煮蛋感官品质不断下降，这与葛帅等[26]关于熟鸡蛋质构特性的研究结果一致。结果显示，蛋清的硬度及咀嚼性与其水分体积分数呈现明显负相关，即其水分体积分数越低，这两个指标数值越大。分析其原因，在贮藏中随着蛋白质持水能力降低，水分不断损失，尤其是不易流动水的减少，使得蛋白之间相互作用增强，形成交叉的连接作用，导致硬度和咀嚼性的增大，感官品质下降[27]。已有研究发现水分体积分数是影响肉及红肠的硬度和咀嚼性变化的重要因素[6]。同时实验中发现，贮藏前期带壳蛋黄（4 ℃）的硬度及咀嚼性出现先减小后增加的变化（图5b、d），可能原因是低温能较好地保持蛋黄内部的水分，同时蛋黄内部脂肪逐渐溶出，使得蛋黄逐渐变得松沙，因而测定值在前期降低；但随着贮藏时间的延长，水分损失增加，加之脂肪氧化导致脂肪含量减少，蛋黄硬度及咀嚼性逐渐增加。对比不同贮藏条件的白煮蛋，冷藏带壳可有效保持白煮蛋的质构特性，与新鲜白煮蛋相比，贮藏60 h的蛋清及蛋黄硬度分别增加了69.4%和4.1%，咀嚼性分别增加了83.4%和14.9%，在所有样品中变化幅度最小。余秀芳[28]也研究发现不同的贮藏条件会影响卤蛋产品的最终质构特性。

图5 贮藏过程中白煮蛋硬度和咀嚼性变化Fig. 5 Changes in hardness and chewiness of boiled egg white during storage

2.5 白煮蛋微观结构的变化

由图6a所示，新鲜的白煮蛋蛋清凝胶表面有大量的孔洞存在，凝胶微观结构类似于“蜂窝”状，表明白煮蛋蛋清三维网络结构疏松，存在较多的持水空间，这种微观结构赋予了蛋清适宜的弹性和劲道，口感宜人。图6b、c显示，4 ℃贮藏60 h后，带壳蛋清凝胶网络结构发生变化，表面变得略微紧密，但仍存在一定量的孔洞，而4 ℃贮藏60 h的去壳蛋清孔洞减少的更加明显，凝胶网络结构较带壳组更加致密。25 ℃贮藏60 h的带壳蛋清（图6d）凝胶微观结构较4 ℃带壳蛋清致密，几乎看不到较大的孔洞，表明常温贮藏过程中，即使有蛋壳保护，也会改变蛋清凝胶微观结构，使蛋清持水区域减少，凝胶持水能力下降；去壳蛋清（图6e）凝胶网络结构发生更大的变化，样品表面十分致密，几乎看不出任何孔洞，表面均匀、光滑、平整，持水空间显著减少，这与LF-NMR测定的不易流动水体积分数减少相符，这种微观结构使得蛋清硬度和咀嚼性显著增加，蛋清变硬，失去适宜口感。

图6 贮藏60 h白煮蛋蛋清微观结构（10 000×）Fig. 6 Microstructure of boiled egg white after storage for 60 h (10 000 ×)

2.6 白煮蛋贮藏过程中颜色的变化

由表3可知，新鲜白煮蛋蛋清的L*、a*、b*值分别为87.29、－3.55、9.53，与其对比发现，4 组样品在贮藏12 h时，L*、a*、b*值总体无显著变化，在12 h后，随着贮藏时间的延长，L*值呈下降趋势，相反的，a*值和b*值呈上升趋势，表明白煮蛋蛋清颜色逐渐变暗，向红黄色方向转变。对比分析发现，贮藏温度对白煮蛋蛋清颜色无显著影响，但去壳处理使得白煮蛋颜色发生显著变化，同一时间下，去壳处理使L*值下降，a*值上升，可能的原因是白煮蛋去壳后，蛋白中赖氨酸在贮藏期间不稳定，发生非酶褐变，引起颜色变化[29]。此外，贮藏过程中蛋清水分体积分数降低，白煮蛋蛋清凝胶体系中蛋白所占比例发生变化[19]，进而影响蛋清的色泽。

表3 贮藏过程中白煮蛋颜色变化Table 3 Changes in color parameters of boiled eggs during storage

新鲜白煮蛋蛋黄的L*、a*、b*值分别为81.26、4.34、51.06，在贮藏过程中，4 组样品蛋黄的L*、a*、b*值均呈下降的趋势，表明随贮藏时间的延长，蛋黄颜色逐渐变暗，黄色逐渐变浅。刘丽莉等[21]在研究卤蛋蛋黄颜色变化时发现相似的变化趋势。这是因为蛋黄中含有较多的水溶性玉米黄色素，在贮藏过程中色素溶解，随水分的流失而减少，导致b*值下降，同时脂肪氧化也会影响蛋黄颜色的变化。陈景宜[30]发现，肉制品加工贮藏过程中，会促进内部脂肪发生氧化，导致其褪色或变色，从而使L*、a*值变化。这与本研究的结果一致。

3 结 论

白煮蛋在不同的贮藏条件下品质均发生了变化，表现为硬度和咀嚼性增加，蛋清颜色变暗变黄，蛋黄黄色消减，其中25 ℃去壳组品质变化最显著，而4 ℃带壳组变化最小。白煮蛋贮藏过程中品质的劣变与其水分体积分数，尤其是不易流动水体积分数的减少相关，同时也受到蛋白及脂肪氧化的影响，后续实验将深入讨论以上指标的相关性问题，如建立表观品质与水分分布及氧化指标之间的相关性模型。因此，以此为理论依据，延长白煮蛋的保质期应考虑维持其合理的水分分布及控制氧化的发生，推测添加天然食品抗氧化剂及螯合剂、采用真空包装、气调包装等技术是延长白煮蛋保质期的有效方法。

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