喷雾干燥和冷冻干燥莲子蛋白结构及其功能特性的比较

时文芳，白 榕，吕丽爽，李建林，沈 丽，张 莉，郑铁松*

蛋白质是人体必需的营养物质，在饮食中需要注重蛋白质食物的摄入。虽然动物性蛋白是食品蛋白质的主要来源，但由于其成本较高且具有潜在的激素和抗生素残留等食用安全性风险，故植物性蛋白资源的研究越来越受到重视[1-4]。莲子中富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和矿物质，还含有水溶性多糖、多酚、莲子心黄酮、生物碱等功能性物质，莲子具有较高的营养和保健价值[5-6]。莲子中蛋白质含量大约为19.0%[7]，远高于同是硬果类的新鲜板栗（含蛋白质5.7%～10.7%）、白果（含蛋白质10.0%～15.0%）、菱角（含蛋白质6.4%）[8-9]；莲子中4 种主要蛋白球蛋白（26.6%）、清蛋白（41.6%）、谷蛋白（18.0%）、醇溶蛋白（6.0%）组分中必需氨基酸都高于或接近联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）推荐值，且清蛋白和球蛋白的预测生物学价值、氨基酸评分值高于FAO/WHO氨基酸模式值[1,10]。因此对于莲子而言，除了其特殊的药补成分之外，对其营养、食用质量和加工性能影响最大的就是蛋白质。

食品中的蛋白质既是影响食品营养性的重要因素，同时也是影响其加工性能的重要因素，并且大量的研究表明，蛋白质的结构和功能特性不但与蛋白质的来源有关，也受蛋白质干燥方法的影响，不同干燥方法会影响蛋白质的理化及结构特性，进而影响蛋白质的品质，而喷雾干燥和冷冻干燥是目前常用的蛋白干燥方法[11-14]。喷雾干燥是将原料液用雾化器分散成雾滴，并用热空气（或其他气体）与雾滴直接接触的方式而获得粉状产品的一种干燥过程[15]。具有干燥迅速、生产过程简化、操作简单、产品具有良好的分散性和流动性等特点。喷雾干燥已经广泛应用于婴幼儿营养食品的加工、各种谷物及水果制粉的加工、鱼油和蛋白粉等功能性产品微胶囊的加工、速溶茶饮料以及调味品加工[14,16]等食品工业。冷冻干燥，是在高真空的条件下，将冻结的物料中的水分直接升华而使物料干燥的工艺，所得产品在复水性、色泽、硬度等方面占有优势，可是由于其干燥时间长，能耗大及设备投资较大的问题，主要适用于生产品质要求严格的高端产品及实验室特定功能成分的制备[5,17]。已有研究比较分析不同干燥方法对小扁豆蛋白[18]、大豆蛋白[19]、大米蛋白[20]理化结构和功能特性的影响，对于莲子蛋白质的提取方法[11,21]、营养性[10]、结构特性[22-23]以及热处理和酶解特性[24]的研究也已有报道，但关于不同干燥方法对莲子蛋白结构特性以及功能特性影响的研究还鲜见报道，鉴于不同干燥方法会影响蛋白质的理化及结构特性，进而影响蛋白质的品质和加工性能；因此本研究拟在本实验室前期研究提取莲子蛋白的基础上[11]对莲子蛋白进行喷雾干燥和冷冻干燥，研究不同干燥方法对莲子蛋白质的结构和功能特性的影响，以期为莲子及莲子蛋白的深加工利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲子（优质去芯湘莲）购于苏果超市；盐酸、氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250 上海谱振生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FW177高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；GL-22M高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司；JJ-1增力电动搅拌机 金坛市医疗仪器厂；FreeZone 2.5L真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；250小型喷雾干燥机 瑞士步琦公司；HD-3紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；JSM-5610LV型扫描电子显微镜 日本电子公司；HP-200精密色差仪上海汉普光电科技有限公司；D/max-rC型阳极转靶X射线衍射仪 日本理学电气公司；Chirascan Plus圆二色光谱仪 英国应用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 莲子蛋白的提取

参照实验室前期建立的方法[11]提取莲子蛋白。将去芯湘莲粉碎，过100 目筛，置于棕色广口瓶中，4 ℃保存。采用碱溶酸沉的方法提取莲子蛋白，100 g的莲子蛋白粉溶于2 500 mL 0.5 mol/L NaCl溶液中，用0.5 mol/L HCl和NaOH溶液调节pH值为11.0，在40 ℃下搅拌提取3 h，6 000×g离心20 min，收集上清液。调节上清液pH值为4.5，6 000×g离心30 min，收集沉淀，然后用去离子水以料液比1∶10（m/V）进行复溶，调节pH值为10备用。

1.3.2 莲子蛋白的冷冻干燥和喷雾干燥

用上述复溶的莲子蛋白制备喷雾干燥莲子蛋白（spray-dried lotus seed protein，SLSP）和冷冻干燥莲子蛋白（freeze-dried lotus seed protein，FLSP）。

SLSP：本实验采用250小型喷雾干燥机为实验机，该设备采用气流喷雾方式，干燥介质为热空气，实验条件：进样温度为170 ℃，进料量为15%，固定热风流量25 m3/h，出口温度为显示值，非人为控制。在此条件下对莲子蛋白进行干燥，在旋风收集器中收集干燥莲子蛋白，4 ℃保存备用。

FLSP：将上述复溶的莲子蛋白平铺在培养皿中，使其厚度约为1 cm，-80 ℃预冻12 h，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12 h，收集，4 ℃保存备用。

1.3.3 色差测定

用精密色差分析仪，对SLSP和FLSP进行色度测量，采集L*（明度差异）、a*（红/绿差异）、b*（黄/蓝差异）值，与白色标板进行比较，分析色差的变化。每个样品测量值取3 次测量的平均值。

1.3.4 扫描电子显微镜分析

将处理后的SLSP和FLSP分别均匀固定在贴胶的电子显微镜进样台上，放入喷金机，真空条件下进行样品的喷金，然后固定在载物台，调节最佳视野和放大倍数进行观察。

1.3.5 X射线衍射分析

蛋白质的晶体结构采用X射线衍射仪扫描法进行。测定条件：特征衍射线为Cu靶、管压40 kV、电流30 mA、测量角度为2θ＝5°～60°、步长0.02°、扫描速率6（°）/min。

1.3.6 圆二色谱

将蛋白粉配制成0.1 mg/mL的溶液，20 ℃下对远紫外区（190～260 nm）进行圆二色谱扫描。扫描条件：波长范围190～260 nm、石英样品池光程1 mm、谱带宽度1.0 nm、灵敏度20 mdeg、响应时间0.25 s、停止时间1 min、扫描速率200 nm/min。

1.3.7 溶解性测定

参照Gong Kuijie等[25]的方法，样品用去离子水溶解为1 g/100 mL，用0.5 mol/L的HCl和NaOH溶液调节样品pH值分别为2.0、4.5、6.0、8.0、10.0、12.0，磁力搅拌30 min，分散体经10 000×g离心20 min，测定上清液中蛋白质的含量，蛋白质的溶解性按公式（1）计算。

1.3.8 持水性和持油性测定

参照Tan等[26]的方法，样品（大约为0.1 g，m0）置于离心管中并一起称质量（m1/g）。然后，将1.5 mL蒸馏水（豆油）加入到离心管中，使用涡旋混合器混合。该混合物样品完全润湿后，将它们在室温下放置30 min，然后3 000×g离心20 min。倾出上清液，并将含有沉淀的离心管称质量（m2/g），持水性和持油性分别按式（2）、（3）计算。

1.3.9 起泡性和泡沫稳定性测定

参照He Xuanhui等[27]的方法，取1.5 g/100 mL蛋白质样品溶液20 mL，在高速乳化均质机以10 000 r/min的速率均质2 min，记录均质后样品体积为V0/mL，静置30 min后再次记录样品体积，记为V30/mL。起泡性和泡沫稳定性分别按式（4）、（5）计算。

1.3.10 乳化性和乳化稳定性的测定

参考郭凤仙[12]的实验方法，配制1 g/100 mL蛋白质溶液，并用0.5 mol/L的HCl和NaOH溶液调节样品pH值分别为2.0、4.5、6.0、8.0、10.0、12.0，根据考马斯亮蓝法测定乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质量浓度（g/mL）。取15 mL蛋白溶液与5 mL大豆油混合，放入试管中。在高速乳化均质机下13 500 r/min乳化2 min。从底部取乳化液20 μL，立即与5 mL 0.1%的SDS溶液混合均匀，在500 nm波长处测定其吸光度，记为A0，乳状液静置30 min后采用相同的方法测定乳状液吸光度，记为A30，用0.1% SDS作空白对照。乳化性和乳化稳定性分别按式（6）、（7）计算。

式中：T为浑浊度（2.303）；N为稀释倍数（250）；ρ为乳化液形成前蛋白质量浓度/（g/mL）；φ为乳化液中油的体积分数（25%）。

1.4 数据处理

实验所涉及到的测定结果均做3 次重复，实验数据用Origin 9.0软件作图，用SPSS软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 SLSP和FLSP的色差分析

不同干燥方法制得的莲子蛋白粉末颜色上有所不同（表1）。

表1 SLSP和FLSP色差比较Table 1 Color difference of SLSP and FLSP

色泽是影响产品外观品质的直观因素，由表1可知，两种蛋白粉末颜色有明显的差异。相比FLSP，SLSP有较高L*值（83.14±0.01）、较低的a*值（2.89±0.04）和b*值（10.92±0.02）（P＜0.05），表明其明度高、色泽好，而FLSP偏红、偏黄。这种颜色上的差别是由于不同的干燥方式制得的蛋白质颗粒大小、形态以及表面结构不同造成的，也可能是由于不同干燥方法对产品美拉德反应的影响不同所致[14]。该结果显示就产品色泽而言，喷雾干燥法优于冷冻干燥法。Joshi等[4]的研究也表明，对小扁豆蛋白而言，喷雾干燥蛋白粉的L*值大于冷冻干燥蛋白粉，a*和b*值则小于冷冻干燥蛋白粉，而无论是喷雾干燥蛋白粉还是冷冻干燥蛋白粉其色泽都优于真空干燥蛋白粉。Ghribi等[14]对鹰嘴豆蛋白粉进行喷雾干燥和40、50 ℃热风干燥的研究也表明，3 种干燥粉末色度存在明显差异，且喷雾干燥是3 种方法中制得产品色泽最好的。

2.2 SLSP和FLSP的扫描电子显微镜观察

扫描电子显微镜是研究分析蛋白质表面结构最常用、有效的工具，其特点是样品制备简单、图像层次丰富、分辨率高等，尤其对有粗糙表面的样品的微观形态结构有更加直观独特之处[25]。

图1 SLSP（A、B）和FLSP（C、D）扫描电子显微镜图Fig. 1 SEM micrographs of SLSP (A, B) and FLSP (C, D)

由图1所示，SLSP粉的表面形态明显不同于FLSP，SLSP颗粒较小，外形基本完整，呈现为大小不一的、外形不规则的、折叠起皱的球形；而FLSP形成表面基本光滑、如盘状的大片层结构。这一结果也与文献报道中对花生蛋白粉[25]、小扁豆蛋白粉[4]和大米蛋白粉[20]的研究结果一致。虽然喷雾干燥处理时间较短，但是其处理温度较高，仍会影响所得蛋白质的理化及结构特性[13]。喷雾干燥过程中，雾化器将物料分散成很小的液滴，迅速与热空气进行接触，物料在短时间内被干燥成粉末进入旋风分离器中，快速减小的水分扩散率和增加的表面张力导致形成凹陷的、折叠起皱的不规则表面；而冷冻干燥样品溶质是水，水在低温（-80 ℃）状态下，迅速地形成冰晶体，分子之间的作用力，如静电作用、共价键作用、疏水作用等更易导致溶质聚合[4,20,25]。因此SLSP形成折叠起皱的球形是由于与热空气接触过程中，物料水分扩散率和气-液界面表面张力变化趋势不同，而FLSP只能形成大片层的结构。由此可见，干燥方法对莲子蛋白粉末的表观形态和内部结构有很大的影响[14,20]。

2.3 SLSP和FLSP的X射线衍射分析

X射线衍射法是测定生物大分子的结构，研究其与功能特性的关系，分析蛋白质构象最经典的方法；并且，X射线衍射技术具有不损伤样品、无污染、快捷、测量精度高、能得到有关晶体完整性的大量信息等特点。

图2 SLSP和FLSP的X射线衍射图谱Fig. 2 X-ray diffraction patterns of SLSP and FLSP

粉末状的物料分为晶型结构、半晶型结构或者非晶型结构。由图2可知，两种不同方式处理的粉末蛋白，具有较为相似的X射线衍射图谱，在2θ＝20°附近都有明显的、强度较高的衍射峰，在8.5°左右出现强度较低的衍射峰，这一结果与Joshi等[4]对小扁豆蛋白粉的研究结果类似。当X射线照射非晶体时，由于非晶体的结构为长短无序、短程有序，不存在明显的衍射光栅，故不产生清晰、明锐的衍射线条[28-29]，图中SLSP和FLSP出现的衍射峰呈现弥散衍射峰特征；因此可以推测SLSP和FLSP为明显的非晶型结构。虽然晶型结构比非晶型结构在储存时表现更加稳定，但由于干燥蛋白为粉末，非晶型的粉末在低含水量保存时具有较好的功能特性，如溶解性、持水性等，同时非晶性粉末容易潮湿，故应保存在干燥通风处[4]。

2.4 SLSP和FLSP的圆二色谱测定分析

圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质二级结构的一种简单、快速的方法。通常蛋白质的圆二色谱段被分为两段，185～245 nm称为远紫外区，远紫外区的吸收信号来自于肽键，用于反映主链的构象，表征蛋白质的二级结构；250～320 nm称为近紫外区，近紫外区吸收则是通过氨基酸信号来反映氨基酸侧链及二硫键。蛋白质二级结构的不同，所产生的圆二色谱谱带位置、吸收强度也不相同，可通过远紫外区的圆二色谱图推算蛋白质分子的α-螺旋、平行β-折叠、反平行β-折叠、β-转角及无规卷曲的含量[30-31]。图3为SLSP和FLSP的圆二色谱图，表2是根据圆二色谱图所得数据对两种不同干燥方法所得莲子蛋白的二级结构分析结果。

图3 SLSP和FLSP的圆二色谱图Fig. 3 Circular dichroism spectra of SLSP and FLSP

表2 SLSP和FLSP的二级结构含量Table 2 Secondary structures of SLSP and FLSP%

从图3中可以看出，两种干燥蛋白的圆二色谱图并无明显差异，两种蛋白在210～220 nm波长处有负峰，这是典型的α-螺旋结构的特征峰[32]。但从表2的数据可以看出，SLSP的α-螺旋含量为22.0%，略高于FLSP的19.0%；SLSP和FLSP的折叠体结构含量分别为25.7%和29.0%，且两种蛋白都是无规卷曲结构含量最大，但SLSP的无规卷曲含量为39.7%，低于FLSP的43.8%；该结果显示两种不同的干燥方法的确对产品的结构有着不同的影响，且喷雾干燥相比于冷冻干燥对蛋白质结构的影响要小。邓芝串等[13]对籽瓜蛋白进行二级结构分析的结果也表明，干燥处理的蛋白质亦是无规卷曲含量最大，且喷雾干燥无规卷曲含量为30.70%，低于冷冻干燥36.66%。同时，Zeng Hongyan等[23]对莲子分离蛋白结构的研究表明，莲子清蛋白和球蛋白的折叠体含量在38%左右，螺旋体在17%以下，而无规卷曲含量则仅有15%左右。由此可见，无论是喷雾干燥还是冷冻干燥，对蛋白质结构都产生了一定的影响，不同程度地促使蛋白质从有规则的结构向无规则结构转化。

2.5 SLSP和FLSP的溶解性

蛋白质的溶解度是食品体系中很重要的指标，因为它作为一个影响着蛋白分子其他功能的重要指标。蛋白质的溶解度受到一些因素的影响，影响条件可以分为外部条件（pH值、离子强度、温度等）和内部条件（疏水作用等），而溶液的pH值对蛋白质溶解度的影响最大[33]。因此，对不同pH值条件下两种干燥蛋白的溶解性进行了比较研究，结果如图4所示。

图4 pH值对SLSP和FLSP溶解度的影响Fig. 4 Effect of pH on solubility of SLSP and FLSP

由图4可知，两种干燥方法所得蛋白粉在pH 2～12的范围内，都呈现出先下降后增大的趋势，并都在pH 4.5时达到最低，趋近于零。这是因为pH 4.5左右是莲子蛋白质的等电点[21]，在等电点时，蛋白质分子静电荷为零，此时蛋白质间静电排斥作用最低，蛋白质聚集、沉淀，导致其溶解度最低。总体来讲，在pH值小于10的情况下，冷冻干燥样品的溶解度普遍高于喷雾干燥样品，因为冷冻干燥样品颗粒疏松多孔，相对较细又较均匀。该结果与Gong Kuijie等[25]对冷冻干燥和喷雾干燥处理的花生蛋白的研究结果一致。有研究报道，乳清蛋白在喷雾干燥过程中，会形成一个很薄、光滑、高抗湿性薄膜，导致其溶解性降低[34]；Joshi等[4]的研究也指出小扁豆蛋白在喷雾干燥过程中形成的薄膜需要一定的水化作用才能使溶剂进入蛋白分子内部，故而喷雾干燥蛋白溶解性降低。

2.6 SLSP和FLSP的起泡性和泡沫稳定性

起泡性是指蛋白质溶于水中，在气-液界面形成薄膜，降低气-液界面的表面张力从而帮助形成起气泡的能力。泡沫稳定性是指蛋白质使所产生的泡沫稳定存在的能力[35]。图5为SLSP和FLSP起泡性和泡沫稳定性的比较。

图5 SLSP和FLSP的起泡性和泡沫稳定性Fig. 5 Foaming capacity and foam stability of SLSP and FLSP

由图5可知，SLSP和FLSP的起泡性和泡沫稳定性有显著的不同（P＜0.05）。文献[35]报道称，不同的干燥方法对蛋白质的结构影响不同，蛋白质的变性程度也不同，分子内部的基团暴露程度不同，从而引起不同干燥方法的蛋白质的起泡性和泡沫稳定性大小的不同。SLSP的起泡性和泡沫稳定性均优于FLSP（图5）；而SLSP的溶解性低于FLSP（图4）。该结果表明，虽然对于泡沫的形成来说，高溶解度的蛋白易于形成附着有力的高弹性多层膜，但坚硬的薄膜也会阻止气泡的黏聚，使起泡性降低，而不溶解的蛋白质提高了表面黏度，阻止泡沫的破裂和结合，从而稳定乳状液，增大其泡沫稳定性[36]。同时，图1中扫描电子显微镜结果显示SLSP比FLSP呈较小颗粒状态，而小颗粒的喷雾干燥蛋白比冷冻干燥的片状蛋白在搅拌起泡时更易吸收[20]，这可能也是前者比后者具有更好起泡性的因素之一。

2.7 SLSP和FLSP的持水性和持油性

持水性和持油性是蛋白质分别与水和脂肪结合的能力。影响蛋白质持水力的因素有蛋白质量浓度、离子种类和pH值等。影响持油性的主要因素是蛋白质产品的种类和来源、蛋白质的含量、颗粒大小、温度、加工方法和pH值等[14]。蛋白质持水性和持油性在食品加工中具有重要的应用价值。

图6 SLSP和FLSP的持水性和持油性Fig. 6 Water- and oil-holding capacities of SLSP and FLSP

由图6可知，SLSP的持水性明显大于FLSP（P＜0.05）。这是因为不同的干燥方法，对莲子蛋白的结构造成不同的影响，喷雾干燥使蛋白粉表面形成高抗湿度薄膜[24]，使其溶解度降低，从而减少可溶性蛋白的损失，从而有较高持水性。而图6也同时表明，冷冻干燥得到的莲子蛋白的持油性则明显高于喷雾干燥（P＜0.05）。这是因为冷冻干燥样品结构疏松，提高了蛋白质-脂类相互作用的程度，且结合疏水性氨基酸作用的结果[37]，导致持油性相对较高。对比前面的溶解性数据，可以看出，溶解性与持水性并不一致，这与Joshi等[18]对小扁豆蛋白的研究结果类似，显示该两种参数间并无直接的相关性。

2.8 SLSP和FLSP的乳化性和乳化稳定性

乳化性是蛋白质能将油、水结合在一起，形成乳状液的性能。乳化稳定性是指在一定时间段内，蛋白质维持油水混合不分离，抵制不稳定因素如聚结、絮凝、沉积等的产生[38]。蛋白质的溶解度是决定着乳化性质的重要特征。具有良好的乳化特性可以使食品体系保持稳定的乳化状态，从而达到延长货架期的目的。蛋白质的乳化性受溶解度、pH值、液滴大小、界面张力、蛋白质构象、黏度等因素的影响，但这些因素中pH值的影响最为显著和直观[20]。

图7 pH值对SLSP和FLSP乳化性的影响Fig. 7 Effect of pH on emulsifying capacity of SLSP and FLSP

图8 pH值对SLSP和FLSP乳化稳定性的影响Fig. 8 Effect of pH on emulsion stability of SLSP and FLSP

由图7、8可知，FLSP和SLSP不论在乳化性还是乳化稳定性方面都有明显不同，因为不同干燥方法会导致蛋白质结构的不同，从而使乳化及乳化稳定性不同[4]。

由图7、8可知，在pH 4.5时，莲子蛋白粉的乳化性及乳化稳定性都为最低，因为pH 4.5是莲子蛋白粉的等电点，在等电点处莲子蛋白的溶解性最低，故而其功能性受到影响。随着pH值高于或者低于4.5，乳化及乳化稳定性都逐渐升高。在整个pH值变化过程中，FLSP粉的乳化性均高于SLSP粉，这是因为蛋白质的乳化性与其溶解度密切相关，溶解度较大，乳化性也相对较高。Ma Zhen等[36]的研究指出，蛋白质的乳化性与其在乳剂中吸收水和油的能力相关，乳化稳定性不仅仅表示溶液形成乳液的能力，还代表其在一定时间内的稳定性。在pH 10时，冷冻干燥蛋白粉和喷雾干燥蛋白粉的乳化稳定性均达到最大值，这与溶解性的结果保持一致。莲子总蛋白氨基酸组成也会在一定程度上影响其乳化性。蛋白质是由多种氨基酸形成肽键构成的，这个过程氨基酸残基会发生电离，蛋白质带有一定的电荷，蛋白质所带电荷量的多少会受pH值的影响。在碱性条件下，由于羟基的作用，使羧基数量增多，使分子间的静电斥力、离散双电层、溶液界面膜增加[39]，影响其乳化性及乳化稳定性。

3 结 论

通过对两种不同干燥方法获得的莲子蛋白粉SLSP和FLSP的比较研究可知，两者的色差和超微结构明显不同，喷雾干燥蛋白的L*值为83.14±0.01，大于冷冻干燥的L*值（69.49±0.02）（P＜0.05），整体色泽好，而FLSP偏红、偏黄；SLSP呈现表面褶皱的不规则球状，且形成光滑、高抗湿度薄膜，使其溶解性降低，部分功能特性受到影响，而结构疏松多孔的FLSP能更好地溶解在水中，也是其持水性降低的原因之一，因为高的溶解性增加可溶性蛋白的损失。X射线衍射结果表明，两种干燥蛋白都呈现非晶型结构。圆二色谱分析表明两种干燥蛋白的二级结构无明显差异，SLSP的α-螺旋结构含量大于FLSP，反平行结构、β-转角、无规卷曲含量均降低，但二者均由有规则的结构向无规则结构转化。溶解性是蛋白质功能特性的重要指标，两种干燥蛋白的溶解性受pH值影响的变化趋势相同，但整体FLSP的溶解性大于SLSP，并且FLSP持油性（P＜0.05）、乳化特性均大于SLSP，但是SLSP的起泡特性和持水性（P＜0.05）优于FLSP。因此，在实际加工生产过程中可以趋利避害，选择合适的加工方法，使莲子蛋白发挥其最大功效。

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