儿童肠球菌耐万古霉素表型和耐药基因检测分型的研究*

张彩虹 张学忠

(淄博市中心医院，山东 淄博 255036)

肠球菌已成为导致医院感染的重要病原菌，随着抗菌药物选择压力的不断提高，目前肠球菌获得耐药性明显增强，且呈多重耐药，耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE)所致的医院感染呈逐年上升趋势[1-3]。近些年儿童肠球菌导致败血症的发病率增加了6倍[2]。目前儿童感染VRE的临床治疗相当棘手，可用于治疗VRE感染的抗菌药物非常有限，包括价格昂贵的利奈唑胺、达托霉素及毒副作用较大的氯霉素[4-5]。本研究共采集患儿170个肛门拭子进行肠球菌培养及鉴定，筛选出VRE菌株并进行表型及基因型检测，对VRE定植菌菌种构成、耐药基因型及表型进行检测分析，探讨是否存在新的耐药基因簇，为儿童VRE医院感染防控提供初步实验研究依据。

1 材料与方法

1.1 临床实验菌株 2016年1月～12月期间，每月1次于我院儿科采集10～20位住院患儿肛门拭子，分离经耐万古霉素肠球菌筛选鉴定培养基培养阳性，革兰染色符合肠球菌形态的细菌。质控菌株：由卫生部临床检验中心提供， 粪肠球菌ATCC29212。仪器设备采用梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统，PCR仪 Deltier Thermal Gradient Cycler PTC-200抗菌药物粉剂为庆大霉素、氨苄西林、米诺环素、环丙沙星、利奈唑胺由中国药品生物制品检定所提供，万古霉素、青霉素、替考拉宁购自国药集团药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏实验 采用琼脂对倍稀释法测定万古霉素、替考拉宁、青霉素、庆大霉素、氨苄西林、米诺环素、环丙沙星、利奈唑胺对21株耐万古霉素肠球菌的最低抑菌浓度。MIC值为抑制细菌生长的最低药物稀释度。抗菌药物结果解释和判读均按2015版美国国家临床实验室标准化协会(CLSI)的标准执行[6]，根据所测得的MIC值判读细菌药敏结果为敏感(S)、中介(I)、耐药(R)，见表1。

1.2.2 PCR引物 vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、E. faecalis、E. faecium、rrs (16S rRNA)引物参照文献设计[7]，由广州华大基因生物技术有限公司合成，见表2。

表1 抗菌药物对肠球菌的MIC结果判读标准Table 1 Criteria for judging MIC results of enterococci by antibiotics

表2 用于扩增van基因的引物Table 2 Primers for amplification of van gene

1.2.3 PCR法确认菌种 反应体系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl双蒸水，1.0μl引物1-F，1.0μl引物1-R，1.0μlDNA模板。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重复30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像和测序。

1.2.4 PCR法检测耐药基因型 反应体系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl双蒸水，1.0μl引物2-F，1.0μl引物2-R，1.0μlDNA模板。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重复30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像和测序。

2 结果

2.1 基本情况 本研究中纳入170例儿童肛门拭子中筛选出21株VRE，其阳性率12.4%。在分离的21株VRE中屎肠球菌最常见为14株(66.7%)，粪肠球菌为4株，鹑鸡肠球菌1株，铅黄肠球菌1株和不明菌株1株。

2.2 分离的21株VRE对8种抗生素MIC的测定 本研究中VRE对大部分纳入测定的抗菌药物的耐药率超过50%，包括对环丙沙星的耐药率为90.5%，对青霉素者为81%，对氨苄西林者为76.2%，对庆大霉素高度耐药(High level aminoglycosides resistance, HLAR)为61.9%。而对米诺环素敏感率为95.2%，对利奈唑胺的敏感率为100%，见表3。

表3 8种抗菌药物对21株VRE的MIC值(mg/L)Table 3 MIC value of 8 antibiotics against 21 strains of VRE

2.3 分离的21株VRE对糖肽类抗菌药物耐药情况测定 本研究分离的21株VRE均对糖肽类抗菌药物耐药，见表4、表5。

表4 万古霉素对21株耐VRE的MIC值(mg/L)分布Table 4 MIC value distribution of vancomycin against 21 VRE resistant strains

表5 替考拉宁对21株耐VRE的MIC值(mg/L)Table 5 Teicoplanin against 21 strains of VRE resistant MIC value

2.4 耐药基因的PCR检测及测序

2.4.1 经PCR检测21株耐万古霉素肠球菌耐药基因型，18株含vanA型耐药基因，1株含vanC1型耐药基因，1株vanC2/3型耐药基因，1株耐药基因不明确。vanA基因型是本研究中VRE最常见的耐药基因型。以阴性对照，行PCR，分别选取1株vanA， vanC1、vanC2基因产物电泳成像，见图1。

图1 2%琼脂糖凝胶电泳耐万古霉素肠球菌PCR产物结果

Figure12%agarosegelelectrophoresisresultsofvancomycinresistantEnterococcusPCRproducts

注：M.molecular size marker(1kb ladder) Lanes； 1.阴性对照; 2.vanA基因阳性对照; 3.vanA基因; 4. vanC1基因;5.vanC2/C3基因; 6.屎肠球菌；7.粪肠球菌

2.4.2 将PCR扩增获得的耐药基因片段进行测序(含vanA、vanC1 、vanC2/C3基因菌株各1株), 所得结果与GenBank 上已知序列进行比较, 发现vanA、vanC1 、vanC2/C3基因均未发生突变，见图2。

2.5 追踪VRE定植阳性者 追踪分析VRE定植阳性患者，根据临床医生诊断及有感染症状患者的痰培养、血培养、尿培养等检查，21例VRE定植患者没有继发VRE感染。

3 讨论

研究已证实VRE对大部分抗菌药物耐药[3,5]。VanA与VanB是耐万古霉素肠球菌6个表型中最常见的表型[8-10]。VanA 表型呈万古霉素和替考拉宁均高水平耐药，VanB 表型呈万古霉素高水平耐药, 替考拉宁低水平耐药，VanC 表型呈万古霉素和替考拉宁均低水平耐药，天然耐药[11]。VRE基因型与表型可不一致，据报道，有VanB表型-vanA基因型,VanD 表型-vanA基因型，VanB表型-vanC1+vanB基因型等[12-14]。VRE常常显示多重耐药(如屎肠球菌通常耐氨基糖苷类和青霉素类)，铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌对万古霉素呈低水平耐药。屎肠球菌大多对万古霉素呈高度耐药，而粪肠球菌较少见。

图2耐药基因测序
Figure2Resistancegenesequencing

注：a. vanA(89)-FOR；b. vanA(89)-REW；c. vanC1(116)-FOR；d. vanC1(116)-EWR；e. VanC2/3(53)-FOR；f. VanC2/C3(53)-REW

文献报道[15]，韩国医院15%VRE为VanD表型-vanA基因型，即含vanA基因，却对替考拉宁敏感或中介。通过体内外一系列实验证明，替考拉宁治疗VanD-vanA的VRE菌株感染将会失败。研究提示，尽管VanD-vanA的VRE菌株对替考拉宁敏感，但体内外实验证明替考拉宁对治疗VanD-vanA 型VRE菌株感染无效。通过体外药敏检测VRE菌的表型，不能作为临床治疗中选择抗菌药物唯一的依据，因此在治疗耐万古霉素肠球菌时耐药基因型测定更有参考价值。

粪便、肛门拭子是筛查分离VRE的最常用标本[16]。本研究所取170个肛门拭子中，耐万古霉素肠球菌分离阳性率12.4%(21/170)。耐万古霉素运动肠球菌(铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌)阳性1.2%(2/170)，1株肠球菌不明菌种。21株耐万古霉素肠球菌中菌种分布情况：屎肠球菌66.7%(14/21)，粪肠球菌19%(4/21)，铅黄肠球菌4.8%(1/21), 鹑鸡肠球菌4.8%(1/21)，不明菌种4.8%(1/21)。耐万古霉素肠球菌在屎肠球菌中最常见，与多篇文献报道一致。

本研究中，VRE对大部分检测抗菌药物耐药率超过50%，包括环丙沙星(90.5%)、青霉素(81%)、 氨苄西林(76.2%)、庆大霉素(HLAR 61.9%)。但仍对米诺环素(95.2%)与利奈唑胺 (100%)敏感。21株VRE的万古霉素、替考拉宁MIC范围分别为8μg/mL->512μg/mL、 0.25μg/mL->512μg/mL ，对万古霉素高水平耐药的VRE(MIC，64μg/mL-≥1000μg/mL)18 株，对替考拉宁高水平耐药的VRE(MIC，16-512 μg/mL)14 株。对万古霉素与替考拉宁菌高水平耐药的VRE株14株，万古霉素高水平耐药但对替考拉宁敏感(MIC≤8μg/mL)的VRE 4 株。本研究中，铅黄肠球菌对万古霉素高水平耐药，但对替考拉宁敏感; 鹑鸡肠球菌对万古霉素为中介，但对替考拉宁敏感。

经PCR检测，21株耐万古霉素肠球菌，18株含vanA型耐药基因，1株含vanC1型耐药基因，1株vanC2/C3型耐药基因，1株耐药基因不明确。无vanB型耐药基因。根据PCR结果与药敏结果分析，9株vanA基因型与表型相符，2株vanA基因簇表型为万古霉素中介，替考拉宁敏感，7株VanD 表型-vanA基因型；铅黄肠球菌对万古霉素高水平耐药(MIC=512mg/L)，但对替考拉宁敏感(MIC=4mg/L)，与VanC表型不符; 鹑鸡肠球菌对万古霉素为中介( MIC=8mg/L )，但对替考拉宁(MIC=0.25mg/L)敏感，与VanC表型相符。

本研究中，1株不明菌种且不明耐药基因型，由于本研究中PCR引物只有屎肠球菌、粪肠球菌及vanC1、vanC2、vanC3对应特异性菌株，耐药基因型引物仅有vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3,需进一步测定该菌株16S rRNA及其他6种耐药基因型是否相符,如不相符还应对耐药型进行进一步明确，该菌株表型呈VanA表型。进行了体外药敏实验及PCR检测耐药基因型，仅判断出VRE的表型及基因型， VanD表型-vanA基因型VRE感染是否能使用替考拉宁治疗，仍需要进行体内外实验加以证明。

追踪VRE定植阳性患者，无VRE感染。我院万古霉素的使用合理，手卫生规范，适当隔离与VRE阳性患者密切接触者。因此虽然肛门拭子VRE阳性率12.4%，但VRE定植阳性患者，VRE感染率为0，尚没有出现VRE。国内许多研究报道多家医院已出现了成人VRE，且对VRE同源性及流行性进行了分析报道[9,17，18]。近些年，随着万古霉素的大量应用，VRE的不断出现，儿童中也将会出现VRE[20，21]，因此对肠球菌的耐药监测是势在必行的。

4 结论

本文资料显示，VRE对利奈唑胺、米诺环素较敏感，临床可作为治疗儿童VRE感染的选择药物。本研究中VanA基因型最常见,临床在使用抗菌药物治疗中应予重视。

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