山羊地方性鼻内肿瘤病毒的gag基因克隆及分析

侯宏艳，朱德建，张丹俊，胡晓苗，赵瑞宏，戴 银

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031）

羊地方性鼻内腺癌（Enzootic nasal adenocarcinoma，ENA）是由绵羊鼻内肿瘤病毒（ENTV-1）和山羊鼻内肿瘤病毒（ENTV-2）引起的慢性传染病。ENA呈世界性分布，在法国、意大利、美国、日本、巴西、尼日利亚等国都有绵羊或山羊感染的报道［1-3］。山羊地方性鼻内肿瘤是由ENTV-2引起的一种慢性、进行性、接触性传染病［1］，呈地域性流行，临床表现为呼吸困难、鼻漏、鼻腔内现单侧或双侧增生物［4］，虽然发病率不高，但病死率达100%，且发病的多为成年羊［3］，给养殖户造成较大的经济损失。近年来，在我国内蒙古、湖南、四川、陕西［5-10］等地都有该病的报道，已逐渐引起养羊行业的重视。

安徽省对该病鲜有报道，临床上也不多见，作者在临床上碰到的这起病例在临床特点及病理损伤方面均与国内外报道有高度相似性，为进一步从病原上对该病确诊，本研究开展了分子生物学检测，以便为山羊地方性鼻内肿瘤病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从发生疑似山羊鼻内肿瘤羊场的发病羊群中选出病羊2例，剖检后取鼻腔内肿瘤组织，剪碎研磨后置-80℃保存备用。病毒基因组RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，2×Taqmix，琼脂糖凝胶回收试剂盒，pMD19-T Vector，质粒提取试剂盒，DL2000Marker等均购自上海生物工程有限公司。

1.2 临床症状与剖检病变

在发病羊场了解周围环境、发病情况，并沿矢状切面打开病羊头骨观察病变情况。

1.3 分子生物学检测

根据已发表的GenBank中的已有序列，参照郝中香等［5］的报道，设计一对gag基因部分片段的特异性引物，P1 5'-AAATGCGACCTTCCGATAATGATGA-3'；P2 5'-CTTCTGTAGCGGGGACATATTCTCA-3'，预期扩增目的基因片段长度323 bp，由上海生物工程有限公司合成。

取1.1中研磨好的肿瘤组织，用病毒基因组RNA提取试剂盒提取RNA，用RT-PCR试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，具体操作按说明书进行。以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系（25μL）：2×Taqmix 12.5μL，ddH2O 8.5μL，20μM 的上下游引物各1μL，cDNA模板2μL。PCR反应条件：95℃变性4min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒对目的条带回收纯化，具体操作按说明书进行。纯化后的PCR产物连接到pMD19-TVector，转化TOP10。阳性克隆质粒送上海生物工程有限公司测序，测序结果通过Blast比对。

2 结果与分析

2.1 流行病学和临床症状

该羊场发病羊均为1岁以上的青年羊及成年羊，先有3只发病，后又有2只发病。病羊单侧有大量鼻液流出，鼻液呈灰白状，漏的一侧面部鼓起，明显看到两侧的不同，按压额骨变软。

2.2 病理变化

沿矢状切面打开病羊头骨可见单侧性的增生物，呈粉红色结节状，质地柔软，增生物沿鼻腔生长，使鼻腔闭塞，鼻骨变形。整个鼻腔内充满灰白色的糊状物，覆盖在增生物上（图1）。

2.3 gag部分基因的克隆与序列比对

采用1.3中的引物和方法获得gag部分基因片段，结果得到预期大小的特异性片段，大小约323 bp（图2）。克隆测序后的基因片段与NCBI已报道的核苷酸序列比对，结果显示，得到的序列与NCBI已报道ENTV-2核苷酸序列同源性最高，达99%，表明该病羊感染了ENTV-2。

图1 病羊单侧鼻内肿物

图2 山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag部分基因片段PCR扩增结果

图3 获得的gag部分基因与已报道的核苷酸序列（ID:HM 104174.1）的比对

3 讨论

ENTV-2的临床症状和病理剖检较典型，病羊出现鼻漏、面部肿胀，以及在鼻内发现增生物可作为初期诊断的依据，进一步诊断可借助特异性强、稳定性和重复性均好的RT-PCR快速检测方法。本研究调查了安徽省发生ENT病羊的症状，剖检病羊后观察组织病变，并进行了阐述，初步认定为山羊地方性鼻内肿瘤，另外对病原的gag部分基因片段进行了克隆和序列比对，结果与NCBI已报道ENTV-2核苷酸序列同源性最高，达99%，表明该病羊感染了ENTV-2。

ENTV-2引起山羊鼻内粘膜上皮细胞和肺支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞发生转化，异常增生形成肿瘤。尽管国内外学者在病原方面（包括肿瘤发生机制及免疫应答特点等）进行了深入研究，如谢智勇等［8］对四川发生的羊地方性鼻内肿瘤病毒的SU基因进行了原核表达，何亚鹏等［9］对ENTV-2 Shaanxi株SU蛋白进行了原核表达及多克隆抗体的制备，王彬［10］利用生物信息学软件分析了miRNA差异表达在肿瘤形成中的作用，但都还没有找到有效的防控措施。针对该病主要还是应用RT-PCR方法检测出感染的山羊，通过淘汰病羊进行羊群的净化，并注意养羊场的周边环境是否符合养殖要求，以避免造成长期的危害。

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