湿热环境下不同品种牛血小板活化因子（PAF）的差异表达模式
2018-05-25方东辉付茂忠杨和琴
王 巍 ，方东辉 ，甘 佳 ，付茂忠 ，唐 慧 ，曹 伟 ，杨 嵩 ，杨和琴 ，王 淮 ，易 军
（1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.四川省畜牧总站，成都 610041；3.四川省金川县农业畜牧和水务局，金川 624100）
热应激是指高湿热环境中机体对热环境所做出的非特异性生理反应的总和［1］，可引起机体必要激素分泌受阻、新陈代谢出现不可逆变化，进而影响机体多项功能的发挥［2］。随着畜牧业集约化和产业化程度的提高，饲养密度不断增大，夏季热应激对种公牛生殖系统机能以及精液品质的影响越来越显著［3］。许多种牛场受夏季高温的影响，采精量减少且精液品质不能达到国家标准，被迫停产，直接降低了经济效益。近年来，研究发现血小板活化因子（PAF）作为一种独特的乙酰化的磷脂与哺乳动物精子的活力、顶体反应、获能和受精能力密切相关，能够直接影响排卵、受精、附植前胚胎的发育、胚胎的附植、妊娠乃至分娩［4-5］。通过外源性试验发现，PAF可以提高人精子的活力［6］。多种动物的精子检测发现，PAF作为一类乙酰化的甘油磷脂，是精子原生质膜的脂质类成分之一［7］，具有诱发质膜囊泡化的特性，是精子顶体反应的内源诱导者［8］，可以提高精子的活力，增加低活力精子的运动速度。目前关于具有不同抗逆特色牛品种间PAF差异表达模式的研究尚属空白。
本研究以西门塔尔牛和耐湿热新品种蜀宣花牛公牛为研究对象，分析湿热环境下不同抗逆品种间PAF的差异表达模式，明确抗逆品种蜀宣花牛精液中PAF的特色表达模式，为提高种公牛精子活力相关技术规程的制定提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选择2月龄左右的5头蜀宣花牛和10头西门塔尔牛公牛，统一饲养于宣汉县蜀宣花牛养殖专业合作社，确保饲养条件一致。饲料配方见表1。
表1 精料补充料配方%
1.2 环境THI测定
在牛舍中部距地面1.5m处挂置干、湿球温度计，于2016年9月至2017年3月每日记录9:00、12:00和17:00的干湿温度，利用Sandy Stokes提出的THI公式测定环境温湿指数。THI计算公式如下：
式中：Td为温度，Tw为相对湿度。
1.3 样本采集
每隔5天对实验牛进行人工采精，将采集的精液放入一次性无菌干燥带盖塑料容器内，置37℃恒温水浴箱中，待完全液化后用计算机辅助的精液分析系统（Computer-assisted semen analysis，CASA） 进行精液常规分析，收集剩余的精液以4 000 r/min离心10min，取上层精浆置于Ep管中，-20℃保存备用。
1.4 ELISA法检测
取标本严格按照牛血小板活化因子（PAF）ELSIA试剂盒（试剂盒购自R&D上海卡麦舒）说明书操作，检测PAF，15min内用酶标仪450 nm波长读取OD值。
1.5 统计学方法
数据采用SPSS 17.0统计软件处理，以x±S表示，PAF表达的组间比较均先进行正态性检验和方差齐性检验，视分布情况及方差齐性情况进行t检验。精浆中PAF表达的相关性分析，视是否呈正态分布采用直线相关分析或Spearman秩相关分析，求相关系数（r），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 环境温度变化趋势
实验收集了2016年4月至2017年3月实验牛舍的温度及湿度数据，计算出THI指数值，结果见图1。
国际上按THI指数值将热应激划分为5个等级：THI<72时无热应激，72
图1 圈舍全年THI指数
2.2 牛精液质量的动态变化模式
由图2可见，2016年9月—2017年3月的西门塔尔牛和蜀宣花牛精液密度变化模式相同，均呈S型曲线，9月精液密度最低，2月份和3月份最高。两个品种牛的精子密度均在9—11月份上升速度较快，11—翌年1月份处于平台期，1—3月份缓慢上升。蜀宣花牛各月份的精液密度均高于西门塔尔牛，其中9—11月份，蜀宣花牛的精液密度极显著高于西门塔尔牛（P<0.01），2—3月份，与西门塔尔牛差异不显著（P>0.05）。
图2 精液密度的变化模式
由图3可知，蜀宣花牛的精子活力变化曲线较为平缓，基本在60%左右，12月份开始稳定在60%以上。西门塔尔牛的精子变化模式为S型曲线，9月份最低，2月份和3月份最高。9月份至翌年1月份呈上升趋势，2月份开始基本维持在65%。
图3 精子活力的变化模式
有实验表明，对公牛做24～72 h的阴囊人工局部热处理，使阴囊皮温升高1℃，引起精液品质下降［9］。兔子的热应激控制实验表明，热应激致使采精量、精子活力和密度显著下降（P＜0.05），精子畸形率显著升高（P＜0.05）［10］。本研究结果与上述研究结论相一致，7—8月份的中等热应激使公牛在9月份生产的精液密度和活力下降；12月份和1月份未出现热应激，因此2月份精液密度和活力回升。其中西门塔尔牛的精液密度和精子活力仅为2月份的37%和38%；蜀宣花牛的精液密度和精子活力为2月份的45%和89%。表明热应激对两个品种牛的精子质量均造成了影响。9—10月份，蜀宣花牛的精子密度和活力均极显著高于西门塔尔牛（P＜0.01），说明热应激对蜀宣花牛精子质量的影响小于西门塔尔牛。研究表明，热应激能够抑制下丘脑-垂体-睾丸轴的功能，睾丸分泌的雄性激素下降，从而抑制了精母细胞发育，使种公牛繁殖机能下降［11］，或者直接影响牛精液品质及顶体反应相关酶的活力，从而改变精液密度和精子活力［12］。推测蜀宣花牛在神经体液调节系统和精液品质相关调节酶活性表达模式方面存在特异性，以应对湿热环境对机体的影响。
2.3 不同品种牛PAF的差异表达模式及其与精液质量的相关性分析
如图4所示，蜀宣花牛的PAF变化模式与西门塔尔牛的PAF变化模式存在显著差异。蜀宣花牛PAF表达量标化模式呈二阶段式，9—12月份蜀宣花牛的PAF表达量平均3.92 ng/mL，1—3月份平均3.08 ng/mL。西门塔尔牛的PAF表达量变化模式呈半抛物线，9月份最高，为6.10 ng/mL，3月份最低，为3.02 ng/mL。两个品种牛各月份的PAF表达量存在差异。2016年9月—2017年1月份，蜀宣花牛的PAF表达量极显著低于西门塔尔牛（P<0.01）。2—3月份，两个品种牛的PAF表达量差异不显著（P>0.05）。
图4 PAF的表达模式
通过相关性分析发现，西门塔尔牛精液中PAF的活性与精液密度和精子活力均呈极显著负相关（P＜0.01，r=-0.934；P＜0.01，r=-0.953）；蜀宣花牛的精液中PAF活性与精液密度呈极显著负相关（P＜0.01，r=-0.912），与精子活力呈显著负相关（P＜0.05，r=-0.848）。
研究发现，夏季公猪精浆中的PAF表现较高活性，但动物精液的质量较差［13］。大量研究证明，精液中PAF的含量与精子活力呈显著负相关［5］，与本研究结果相一致。表明牛的精液PAF表达情况与精子质量呈负相关。湿热环境下，蜀宣花牛的PAF表达量变化模式与西门塔尔牛间存在差异，且极显著低于西门塔尔牛（P<0.01），说明蜀宣花牛精子品质相关蛋白PAF的特异性表达模式是导致蜀宣花牛在湿热环境下仍保持精子质量的原因之一。
3 结论
牛的精液PAF表达情况与精子质量呈负相关，热应激对蜀宣花牛精子质量的影响小于西门塔尔牛。
［1］ 金岭梅.猪的热应激及其研究进展［J］.家畜生态，1998，19（3）：38-41.
［2］ 邹胜龙，冯定远.动物热应激机理及其研究进展［J］.广州饲料，2008，9（4）：20-23.
［3］ Aktas C ，Kanter M.A morphological study on Leydig cells of scrotal hyperthermia applied rats in short-term［J］.JMol Histol，2009（40）：31-39.
［4］ Kordan W，Strzezek J.Effect of platelet-activity factor（PAF） on motility parameters and plasmalemma integrity ofboar spermatozoa［J］.Animal Science Papers and Reports，2002，20（1）:37-45.
［5］ Rudebush W E ，Diehl JR.Platelet-activating factor content in boar spermatozoa correlates with fertility［J］.Theriogenology，2001，55:1633-1638.
［6］ Richer D D.The effects of platelet-activating factor on themotility of human spermatozoa［J］.Fertility and Sterility，1989，62（4）：655.
［7］ Harper M L K.Platelet-activating factor：a paracrine factor in preimliantation stages of reproduction ［J］.Biology of Reproduction，1989，40:907-913.
［8］ Hiroyuki A.Platelet-activating factoracetyl hydrolase［J］.Prostaglandins&Other Lipid Mediators，2002，68-69:83-94.
［9］ 杜华，张晋钊，马军，等.种公牛热应激反应与精液品质的探讨［J］.吉林畜牧兽医，2010，1（31）：36-38.
［10］息金波，杨志学，李稻，等.大鼠精索静脉曲张对睾丸氧自由基和LPO浓度的影响［J］.生殖与避孕，1994（4）：297-301.
［11］桑润滋，田树军，李俊杰，等.热应激对荷斯坦种公牛精液品质的影响及机理［J］.中国兽医学报，2002，7（22）：407-410.
［12］ William E Roudebush.Role of platelet-activating factor in reproduction：sprem function ［J］.Asian Journal of Andrology，2001，3（2）：81-85.
［13］Kordan W ，Strzezek J.Age-dependent and seasonal changs in the cativity of platelet-activity factor acetylhydrolase（PAF-AH）of boar seminalplasma in relation to the contentof calcium ions［J］.Animal Science Papersand Reports，2003，21（1）：5-13.
