发酵乳杆菌HCS08-020抑菌功能研究

□ 张晓蕊 范翠翠 徐长隆 王雅丽 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司

益生菌是指对人、动物有益影响的活性微生物，摄入一定数量后，对宿主产生一种或多种特殊且经论证确实存在的健康益处。目前益生菌的作用机制还在探索之中，但已经有一定的共识：益生菌分泌或代谢过程中产生的一些化学物质抑制杀死病原菌；益生菌占据肠道粘膜上皮有害菌结合位点，形成保护屏障；益生菌调节免疫应答，防止感染等。益生菌在体内和体外的发酵过程中，会产生有益的代谢产物，如抑菌蛋白类、多肽类、有机酸类、细菌素类等，这些产物对益生菌抑制有害菌增殖有其至关重要的作用。益生菌的抑菌作用在解决药物残留、抗药性方面有着广阔的应用前景。因此本文采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌等8种菌作为指示菌对是汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司自主分离的发酵乳杆菌HCS08-020及其代谢产物进行了体外抑菌活性的研究，以此收集相关实验数据，为后续公司菌种产品的开发奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 菌种

益生菌：发酵乳杆菌HCS08-020，由汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司分离和保存。指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、单增李斯特菌。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱、厌氧恒温培养箱、冰箱、微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌试管、无菌培养皿、 高压灭菌锅、涂布棒、牛津杯、恒温水浴锅。

1.3 培养基与试剂

LB培养基、沙堡琼脂培养基、营养琼脂培养基、TSA + 5%脱纤维羊血、TSA-YE 培养基、BHI培养基、MRS培养基、无菌水、NAOH、HCL标定液。

2 实验与方法

2.1 菌种发酵液浓缩

取冰箱保存的发酵乳杆菌HCS08-020冻存管1支室温条件迅速溶化，用微量移液器取菌液以1%的接种量于MRS培养基中，37 ℃培养24 h后扩大培养至100 mL，10 000 rpm离心10 min，取上清，加热浓缩至3倍、5倍，放4 ℃备用。

2.2 指示菌株活化处理

各个指示菌培养条件。28 ℃恒温振荡培养箱：培养白色念珠菌（转速100 rpm，48 h）。30 ℃恒温培养箱：培养牙龈卟啉单胞菌（厌氧）、乳双歧杆菌。37 ℃恒温培养箱：培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、变异链球菌（厌氧）。

2.3 牛津杯法抑菌实验

2.3.1 制备含菌平板

制备用于培养各指示菌的固体培养基平板，将培养至对数期的各指示菌稀释至菌液浓度为105CFU/mL，取菌悬液100 μL均匀涂布于培养基上，每株指示菌涂布3个平板（为一组）。

2.3.2 添加抑菌物质

用镊子将无菌牛津杯竖于涂有菌液的平皿中，每皿三平行，每组平板分别加入200 μL原倍上清液、3倍浓缩和5倍浓缩上清液。

2.3.3 测量抑菌圈直径

将平皿正置于适宜温度的恒温培养箱中培养相应时间，观察抑菌圈形成情况并拍照，同时用游标卡尺计量抑菌圈直径。

3 结果与分析

3.1 结果

发酵乳杆菌HCS08-020抑菌结果见表1。

表1 发酵乳杆菌HCS08-020抑菌结果

3.2 分析

通过试验结果可以得出：发酵乳杆菌HCS08-020的代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌有抑菌作用，且随着发酵液浓缩倍数的递增抑菌效果增强；但对单增李斯特菌、白色念珠菌、牙龈卟啉单细胞菌和变异链球菌未表现出抑制作用。

本文初步对发酵乳杆菌HCS08-0201代谢产物的抑菌效果进行了评价，由结果可以看出发酵液浓缩倍数越大对人体某些常见致病菌的抑菌效果越显著。这可能是代谢产物中抑菌成分被浓缩引起的，之后还需要对抑菌成分进行提取分析，并提高该菌分泌抑菌成分的能力，以期对该菌种进行更好的开发。