天龙混合酶最佳酶解工艺研究

王 静，顾正位，史 磊，黄志强，明 璐，孙琪琪

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

天龙，又名守宫，为壁虎科动物无蹼壁虎(GeckoswinhoanaGunther.)或多疣壁虎(G.japonicumDumeril.etBibron.)的干燥全体[1]，夏天秋天的时候对其进行捕捉，将其摔死或者用开水烫死，再晒干或焙干。未被《中华人民共和国药典》(2015版)收录，只作为地方药使用，天龙味咸，性寒，有小毒，功用有补肺肾、益精血、祛风定惊、止咳平喘、散结解毒、通络止痛[2]，用于中风瘫痪，风湿关节痛，骨髓炎，淋巴结结核，肿瘤。天龙的药理作用是其无疣壁虎乙醇的提取物肌注能增强阈下剂量戊巴比妥钠对小鼠的催眠作用；腹腔注射使小鼠转棒爬动能力降低、自发活动明显减少，提示壁虎有镇静催眠作用[3]。有文献表明天龙具有抗肿瘤的作用，现代临床常用于消化道等恶性肿瘤的治疗[4]。临床上的用法是将天龙炒研细粉，每服3～5分；或者是0.5～1.5钱，用水煎服。由于天龙的功效，现在很多制药企业将天龙与与其相辅相成的其他中药材和辅料加工成有效的配方和剂型，例如：骨痛消。近年研究表明，小分子生物活性肽具有较好的抗肿瘤作用[5-6]。在前期做过的研究中，发现天龙粉发酵后的酶解提取物抗肿瘤效果显著[7]，而且不同酶解提取物的抗肿瘤效果有明显差异，其中胰蛋白酶和弹性蛋白酶作用较强[8-9]。故本实验以胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为酶解用酶，使用正交试验方法，根据天龙粉酶解后的蛋白质水解度，筛选出最佳酶解工艺。

1 仪器与试药

1.1 样品

天龙冻干粉自制(批号:20150801)。

1.2 仪器[7]

十万分之一电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)；UV 9100B紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；EL340i型全自动酶标仪(Molecular Davices)。

1.3 试药

天龙冻干粉自制(批号：20150801)；胎牛血清(赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；胰蛋白酶(3000U)、弹性蛋白酶(5000U)(上海源叶生物科技有限公司)；改良型RPMI-1640培养基；注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技术有限公司)；甘氨酸(国药集团化学试剂有限公司)。

2 实验方法

2.1 正交试验设计

本实验拟采用进行正交试验法来探究天龙粉的最佳酶解工艺。选择酶解温度(A)、酶解时间(B)、pH值(C)、和加酶量(D)影响蛋白酶活性的四个因素，以蛋白质的水解度为指标，进行四因素四水平L16(4)4的正交试验如表1。

表 1 天龙粉酶解工艺正交试验设计

2.2 氨基肽氮的含量测定[7]

2.2.1 茚三酮显色剂的配制

称取茚三酮约0.5 g、果糖0.3 g、Na2HPO310.0 g、KH2PO36.0 g，精密称定，定容至100 mL，放入冰箱于4℃下冷藏。

2.2.2 标准曲线的绘制

甘氨酸约0.1 g，干燥至恒重，精密称定的溶解后定容至100 mL，稀释至40 μg/mL，分别取0.5、1、1.5、2、2.5 mL上述溶液定容到10 mL，配成浓度为2、4、6、8、10 μg/mL的标准溶液。取4 mL标准溶液于试管中，加入茚三酮显色剂2.00 mL，沸水浴加热15min，同法平行空白试验，沸水浴后，冷水冷却，加入40%乙醇溶液10.00 mL混匀，静置15 min，于λ570 nm处测定吸光度A，计算回归方程并得到标准曲线。

2.2.3 天龙粉氨基肽氮含量测定

精密称取天龙粉1 g，置250 mL的具塞锥形瓶中，按料液比1∶30，加入蒸馏水30 mL，塞紧，称重，室温下超声20min，称定重量，用水补足失重，然后用1%的盐酸溶液和1 mol·L-1氢氧化钠溶液调整pH值，放入规定温度下的水浴锅中，加入蛋白酶，摇匀，培养相应时间后，取出，在3000 r·min-1下离心10min，倾去上清液，抽滤，收集续滤液，定容至100 mL。取每种天龙粉水解液适量定量稀释到合适的浓度，按照2.2.2的步骤测定天龙粉各提取物样品的吸光度A，计算氨基的含量。

2.2.4 测定原料中总氮量[10]

取天龙粉药材适量，精密称定，加到50 mL凯氏烧瓶中，加硫酸钾0.3 g、30%硫酸铜溶液5滴、硫酸2.0 mL，先小火后大火至溶液沸腾成澄明的绿色后，继续加热10min，放冷。加水2 mL，取2%硼酸溶液10 mL，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液5滴，将凯氏烧瓶中内容物经由漏斗转人蒸馏瓶中，用水少量淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次，再加入40%氢氧化钠溶液10mL，用少量水再洗漏斗数次，关止水夹，加热瓶进行水蒸气蒸馏，至硼酸液开始由酒红色变为蓝绿色时起，继续蒸馏约10min后，将冷凝管尖端提出液面，使蒸气继续冲洗约1min，用水淋洗尖端后停止蒸馏。

馏出液用硫酸滴定液(0.005 mol/L)滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白(空白和供试品所得馏出液的容积应基本相同，70/75 mL)试验校正。每lmL硫酸滴定液(0.005 mol/L)相当于0.1401 mg的N。

2.3 计算样品蛋白质水解度[7]

水解度(Degree of Hydrolysis，简称DH)是指蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质总肽键数的比值。按下式计算样品蛋白质水解度。

3 实验结果

3.1 甘氨酸的测定结果

图1 甘氨酸的标准曲线

3.2 正交试验结果及分析

用半微量凯氏定氮法测定1.0000g原料中总氮含量为82.3104 mg，根据公式计算出正交试验16次结果的水解度，结果如表2。

表2 天龙粉酶解工艺条件的正交试验设计及结果分析

表2(续)

经spss处理后得到结果见表3。

表3 正交试验的显著性试验

结果表明：通过表2可知，酶解温度为45℃、酶解时间为5h、酶解pH值为8.5、加酶量为2500U·g-1时水解度最高。所以，由蛋白质水解度筛选出的天龙粉混合酶的最佳酶解工艺：酶解温度为45℃、酶解时间为5h、酶解pH值为8.5、加酶量为2500U·g-1。又根据表2中的R值和表3得知，各因素对水解度的影响程度由大到小是酶解温度>酶解pH值>酶解时间>加酶量,即酶解温度对水解度的影响最大，其次是酶解pH值和酶解时间，加酶量对水解度的影响最小。

4 讨论

现代研究表明，动物药酶解后得到的小分子活性肽，其生物活性更强，而酶则表现为专一性。通过前期实验发现，天龙粉经胰蛋白酶或弹性蛋白酶酶解后其抑制肺腺癌细胞(A549)的作用较其他蛋白酶效果更好，故本实验使用胰蛋白酶和弹性蛋白酶的混合酶来酶解天龙粉，并测定其酶解后的蛋白质的水解度并通过药理实验验证。经实验发现，天龙粉经混合酶酶解后，其水解度较单一酶有所提高，推断酶解后生成更多的小分子肽[5-6]。胰蛋白酶和弹性蛋白酶最适宜的pH值在建瓯都是8.0，而它们的作用机理是在弱碱性条件下中和多种肽键水解过程中断裂的羧基，而有利于水解和释放活性小分子肽[11]。然而最佳酶解工艺为酶解温度45℃、酶解时间5 h、酶解pH值8.5、加酶量2500U·g-1，可能是温度对水解度的提高大于酶解pH值的影响导致。

参考文献

[1]山东省药品监督管理局.山东省中药材标准[M].济南:山东友谊出版社,2002:273.

[2]刘玉军,李 刚,马 睿,等.天龙抗肿瘤研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011(7):262-264.

[3]李经纬.中医大词典[M].2版.北京:人民卫生出版社,2004:1960.

[4]侯新楠.壁虎抗肿瘤研究[D].北京:北京中医药大学,2008.

[5]徐桂华,毕力夫,苏秀兰.抗肿瘤生物活性肽研究进展[J].中国医药生物技术,2007,2(2):130.

[6]张延坤,张东祥.生物活性肽的抗肿瘤作用及其机理研究进展[J].中国生化药物杂志,2006,27(6):379.

[7]王集会,朱明珠,王 颖,等.中药天龙发酵前后与酶解提取物抗肿瘤效果研究比较[J].山东化工,2007(6):20-22.

[8]王 颖,蔡梅超,王立娜,等.天龙粉酶解工艺中最佳用酶的研究[J].中南药学,2017(9):1221-1224.

[9]焦方文,王集会,邹 龑,等.全蝎粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选[J].时珍国医国药,2015(10):2407-2408.

[10]国家药典委员会.中国药典(2015年版) 第四部 药典附录[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[11]王 颖,王立娜,刘春雨,等.不同蛋白酶对天龙粉水解作用的比较研究[J].化工时刊,2017,31(2):19-21.