MTT法比较天龙发酵前后抗肺腺癌A549细胞效果

刘 颖，王彦多，曹广超，施东方，吕迎兰，王集会，史 磊*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355)

天龙Gekko(L.)学名壁虎，又称守宫、檐龙。其作为我国传统的中药材，性寒味咸，具有祛风止痛、通络散结、解毒定惊等作用[1]，历史悠久。现今更有研究表明中药天龙在抗肿瘤、促进再生和调节免疫力等方面具有药用价值[2]，特别是在对抗恶性肿瘤、结核病、骨髓炎等疑难杂症具有药用价值和发展前景[3]。

本实验采用白僵菌对中药天龙粉发酵，然后对比发酵前后天龙水提物与醇提物对肺腺癌A549细胞的抑制效果，为今后对中药天龙的深入研究奠定基础。

1 实验耗材

1.1 试剂

蒸馏水；无水乙醇(郑州卓利化工产品有限公司)；改良型RP-MI-1640培养基、胎牛血清(赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技术有限公司)；MTT、DMSO(武汉市盖云天生物技术有限公司)；注射用顺铂(20mg/支，批号：30200896， 齐鲁制药有限公司)。

1.2 仪器

FA1004N十万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；disb-zc型低温冷却循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；ST 16R高速冷冻离心机(默飞世尔科技(中国)有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；EL340i型全自动酶标仪(Molecular Davices)；Memmert CO2培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)；100型Nikon 倒置显微镜(Japan)。

1.3 药品

天龙粉(批号：20150801)；发酵天龙粉(批号：20151001)。

1.4 细胞

肺腺癌A549细胞株(由山东省立医院提供)。

2 实验方法

2.1发酵天龙粉的制备

参照文献[4]中 2.1项下制备发酵天龙粉。

2.2 水提物的制备

取发酵前后天龙粉各0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入15 mL蒸馏水加塞超声提取20min，抽滤，取滤渣再次置于锥形瓶中，重复上述操作共3次并将3次滤液合并。按照3000 r/min离心10min，然后置于冷冻干燥机中制备冻干粉。

2.3 醇提物的制备[5]

取发酵前后天龙粉各0.5 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL 80%乙醇，80℃水浴回流加热75min，抽滤，取滤渣再次置于圆底烧瓶中，重复上述操作并将两次滤液合并。将滤液置于蒸发皿中，40℃水浴锅加热下蒸干溶剂得到浸膏。

2.4 MTT法体外实验

2.4.1 配制不同浓度药物

取2.2项和2.3下的提取物0.0100 g，加入5 mL 1640培养基，配制成药物浓度为2 mg/mL的稀释液。在生物安全柜中用0.22 μm的滤膜过滤2次，然后用无菌1640培养基将稀释液再次依次稀释为2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的浓度。

2.4.2 抑瘤实验

将形态良好、处于对数生长期的肺腺癌A549细胞接种于96孔细胞培养板，去除边缘效应并预留3个调零孔，每孔100 uL，放置在培养箱中37℃、5% CO2浓度培养24 h。24 h后取出细胞板，轻拍细胞板背面使原有培养液流出，加入2.4.1项下药物，每个药物浓度重复5个孔，每孔100 μL；再向另外5个孔中加入无血清的1640培养基作为空白组，每孔100 μL；向剩下5个孔中加入浓度为100 mg/mL的顺铂作为对照组，每孔100 mL，放入培养箱中相同条件培养24 h。24 h后取出细胞板避光加入MTT，每孔20 μL，放入培养箱继续培养4 h。4 h后取出，将药物和MTT一并吸出，加入DMSO，每孔100 μL。将细胞板放入酶标仪中于490nm波长处测定OD值，按下式计算抑制率。

3 结果与分析

3.1 天龙水提物

图1 发酵前后天龙水提物对肺腺癌A549细胞的抑制效果

从图1中可以看出发酵前天龙粉水提物对肺腺癌A549细胞没有抑制作用，而发酵后的天龙粉水提物在药物浓度为2 mg/mL时对肺腺癌A549细胞的抑制率可高达96.69%。本组实验中阳性对照顺铂组的抑制率为61.49%，可见发酵后天龙粉水提物对肺腺癌A549细胞的抑制效果相比于临床常用药顺铂更具有优势。

3.2 天龙醇提物

图2 发酵前后天龙醇提物对肺腺癌A549细胞的抑制效果

从图2中可以看出发酵前天龙粉醇提物对肺腺癌A549细胞并没有抑制作用，反而相当于营养物质有助于细胞增殖。而发酵后天龙粉的醇提物对乳腺癌A549细胞具有良好的抑制效果。在药物浓度为0.5 mg/mL时即可达到抑制率90%以上，药物浓度为2 mg/mL时抑制率达到最高为99.14%。本组实验中阳性对照顺铂组的抑制率为59.38%，可见发酵后天龙粉醇提物对肺腺癌A549的抑制效果相比于顺铂也更具优势。

4 讨论与结论

发酵是中药研究领域的一种常用手段，大多应用于植物类中药，而本实验将虫类中药天龙进行生物发酵，具有一定的创新性和研究意义。而且生物发酵也是中药炮制与加工的一种方法，许多发酵后的中药在临床研究中也取得良好成果[6]。

白僵菌是一种药物真菌，它在发酵过程中通过生物转化会生成许多或水溶或脂溶性的具有药理活性的物质，例如多肽、多糖、黄酮、萜类化合物等。这些次生代谢产物除了对人体多个系统具有防病治病的功能外，还具有抗癌抗炎、抗氧化等作用[7]，因此本实验采用白僵菌发酵中药天龙也是以得到这些次生代谢产物为目的。

本实验中采用超声水提法可得到天龙粉中水溶性活性物质，如水溶性蛋白、多糖、核酸、维生素等。王颖[8]等人在前期研究中已发现中药天龙发酵后水溶性蛋白与多糖的含量增多，尤其是蛋白质含量可达发酵前的两倍。可大致推测发酵后天龙水提物具有抗癌效果可能与蛋白质含量剧增有关，但实际情况还需要继续分离纯化来验证，目前提供了研究方向。使用80%乙醇对天龙粉进行回流提取时可使大量的黄酮类物质溶出，避免了极性过小的脂溶性大分子物质和极性过大的水溶性物质溶出对醇提物的纯度进行干扰，但仍然难以避免部分水溶物质[5]，其水溶部分可今后继续研究。

本次实验证明了白僵菌发酵后的天龙不论水提物还是醇提物对肺腺癌A549细胞都具有良好的抑制效果，相比之下醇提物更具优势，这为今后中药天龙对抗肺腺癌549细胞株的研究指明了方向。

参考文献

[1]王 颖,蔡梅超,王立娜,等.天龙粉酶解工艺中最佳用酶的研究[J].中南药学,2017,15(9):1221-1224.

[2]刘妍婕,吴小东,徐寒梅.壁虎药用价值的研究进展[J].药学进展,2015,39(12):915-919.

[3]叶云珍.中药壁虎的研究进展[J].中药材,2009,32(7):1160-1163.

[4]刘 颖,刘春雨,曹广超,等.美洲大蠊粉发酵前后水溶性活性物质含量对比研究[J].化工时刊,2017(3):1-3,6.

[5]王彦多,刘春雨,吕世洁,等.正交实验法优化发酵蜈蚣粉中总黄酮提取工艺[J].食品工业科技,2017,38(7):183-186,192.

[6]李 津,宋 强.药用真菌发酵中药及复方的可行性分析[J].辽宁中医杂志,2014,41(1):48-49.

[7]李 羿,杨 胜,万德光. 药用真菌液体发酵研究进展及存在问题探讨[J].中草药,2012(10):2066-2070.

[8]王 颖,马明珠,王立娜,等.发酵前后天龙粉水溶性活性物质含量对比研究[J].湖南中医杂志,2016,32(9):166-168.