正交试验优化沙地油栗硒多糖提取工艺研究

余小双，徐元芬，张 驰,2*

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

板栗是我国栽培最早的果树之一 ,具有养胃健脾 、补肾强筋 、活血止血、增强免疫等功效,具有显著的药用价值和保健功能 , 深受国内外消费者的青睐[1]。板栗营养价值很高, 含淀粉 51 %～60%, 蛋白质 5.7%～10.7 %, 脂肪 2.0%～7.4 %,多糖 、粗纤维 、胡萝卜素、维生素 A、B、C及钙 、磷 、钾等矿物质[2]。硒元素是人体必需的微量也是重要的矿物质营养素，是人体健康和动物体内必需的 14 种微量元素之一, 兼具营养、毒性和解毒三重生物学功能, 被称为生命的保护剂[3-4]。全世界大都属于缺硒地区，恩施作为世界硒都，拥有丰富的生物硒资源。通过高硒地区植物的转化作用将无机硒转化为有机硒，通过开发含硒化合物，不仅可以作为一种天然的补硒剂，也可以作为抗氧化和衰老的保健品，产生巨大的经济和社会效益，具有良好的开发前景。硒多糖具有抗金属中毒作用、抗氧化、抗癌细胞和病毒作用。本研究选取恩施产富硒板栗，研究得到硒多糖提取的最佳工艺条件,对于促进富硒农产品开发, 提高人体硒的摄入量, 对于提高缺硒地区、缺硒居民群体的健康水平具有重要的意义，对以后硒的开发利用奠定了理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

恩施市沙地乡富硒板栗。

1.2 试剂与仪器

苯酚(AR)，浓硫酸(AR)，氯仿(AR)，正丁醇(AR)，葡萄糖(AR)，乙醚(AR)，无水乙醇(AR)；硒标准溶液(100μg/mL)，中国计量科学研究院；实验用水为双蒸水和超纯水。 FA1004B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；G80w 23CSL-F9(SO)型微波炉：Galanz 格兰仕；HWS26型数显恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；GXZ-9140数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备；TDL-80-2B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；WFJ 7200型可见分光光度计：尤尼科(上海)仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司；ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机：德国Marin Christ 公司；SH220石墨消解仪：济南海能仪器有限公司；AFS-930 d原子荧光光度计：北京吉天仪器有限公司；超纯水器(HUMAN)：韩国。

1.3 实验方法与步骤

1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作

标准葡萄糖溶液的配制：准确称取0.01 g的葡萄糖(烘干至很重)，定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液，在490 nm波长下测定其吸光度。

1.3.2 同单因素条件下提取板栗硒多糖

1.3.2.1 样品的制备

板栗→剥壳→烘干→磨粉→过筛(80目)→置于干燥器中保存待用。

1.3.2.2 硒多糖的提取

硒多糖的提取分离[5-7]：板栗粉(0.1g)样品→热水浸提→离心(6000r/min、10min)→取上清液→醇沉(加四倍体积乙醇、4℃冰箱过夜)→离心(6000r/min、10min)→取沉淀定容至50mL→测多糖和硒含量。

1.3.2.3 多糖提取单因素实验

研究四个单因素对板栗多糖提取效果的影响，分别为：不同超声波[8-10]处理时间(5、10、15、20、25min)；不同水浴浸提温度(40、50、60、70、80℃)；不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)；不同浸提时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)。设计四因素三水平正交试验方案，研究其最佳提取工艺。

(1)因素A:超声波处理不同时间(其它因素：温度60℃、浸提时间0.5h、料液比为1∶30)。

(2)因素B:不同温度(其它因素：超声波10min、浸提时间0.5 h、料液比为1∶30)。

(3)因素C:不同料液比(其它因素：超声波10min、水浴温度60℃、浸提时间0.5 h)。

(4)因素D:不同的浸提时间(其它因素：超声波10min、料液比：1∶30、水浴浸提温度60℃)。

1.3.3 硒多糖提取正交实验的设计

提取因素水平确定见表1。

表1 因素水平表

1.3.4 多糖及硒含量的测定

多糖含量测定采用硫酸苯酚法[5]，硒含量测定采用双道原子荧光法[11-12]。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

根据苯酚-硫酸法，得到的葡萄糖标准曲线方程为：Y=17.31X-0.0149，相关系数为R2=0.9959。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 不同超声波处理时间对板栗硒多糖提取率的影响

超声波处理不同的时间(其它实验因素：温度60℃、浸提时间0.5 h、料液比为1∶30)，测定的板栗硒多糖的提取率结果如图1所示。

图1 超声波处理时间对提取率的影响

由图1可知，不同超声波处理条件下，板栗硒多糖的提取率有所不同，当超声波处理时间为15min时，硒多糖的提取率最高，最佳超声波处理时间为15min。

2.2.2 不同温度处理对板栗硒多糖提取率的影响

不同温度下水浴浸提(其它实验因素：超声波处理10min、浸提时间0.5h、料液比为1∶30)，测定的板栗硒多糖的提取率结果如图2所示。

图2 温度对提取率的影响

由图2可以看出，水浴不同浸提温度下，得到的板栗硒多糖的提取率也不同，且当温度为50℃时，提取率最高，由上可知，最佳水提温度为50℃。

2.2.3 不同料液比处理对板栗硒多糖含量的影响

不同料液比下浸提(其它实验因素：超声波处理10min、浸提时间0.5 h、水浴浸提温度60℃)，测定的板栗硒多糖的提取率结果如图3所示。

图3 料液比对提取率的影响

由图3可以看出，不同料液比条件下，得到的板栗硒多糖的提取率也有所不同，且当料液比为1∶15时，硒多糖提取率最高，可知最佳料液比为1∶15。

2.2.4 不同浸提时间处理对板栗硒多糖提取率的影响

不同的浸提时间(其它实验因素：超声波处理10min、料液比：1∶30、水浴浸提温度60℃)，测定的板栗硒多糖的提取率结果如图4所示。

图4 浸提时间对提取率的影响

由图4可看出，不同水提时间下，所得板栗硒多糖的提取率也不同，当浸提时间为1.5 h时，提取率最高，可知最佳水浴浸提时间为1.5 h。

2.3 正交实验设计的结果与分析

正交实验提取分析的数据结果如表2所示。

表2 正交试验结果

表2为正交实验分析结果，有表可知，FA=5.160，FB=3.838，FC=0.536，FD=3.664，因素A和B和D三因素显著性水平>0.05，而C的的显著水平<0.05，且显著性大小为A>B>D>C,这表明不同的超声波处理(A)和不同的温度处理(B)和处理时间(D)不同对实验结果有显著影响，而料液比(C)对实验结果影响不显著。

表3 主体间效应的检验

由正交试验方差分析结果可知，最佳正交试验组合为A3B3D1C2、即最佳提取条件为超声波处理15min、温度为60℃、料液比为1∶15、提取时间为1 h，并且在最佳提取条件下，吸光度值为0.454，根据葡萄糖标准曲线计算出提取率为1.35%。

2.4 硒含量测定的结果与分析

表4 硒含量测定结果

由表4数据结果分析可知，板栗中和提取分离后的多糖中都含有一定量的硒，由于板栗比较常见，营养价值高，所以研究富硒板栗对人体健康保健等方面具有重大的意义。

3 结果与讨论

本实验采用恩施市沙地乡富硒板栗为实验原料,通过正交试验对板栗中硒多糖的最佳提取工艺条件进行了研究，得到板栗多糖的最佳提取工艺条件为：超声15min、温度60℃、料液比1∶15、浸提时间为1 h，在最佳的提取工艺下，板栗多糖的提取率为1.35%；用双道原子荧光法对硒含量进行了测定，并且测得板栗样品的硒含量为2.715μg/g ，提纯多糖硒含量为0.429μg/g。由于板栗中多糖的含量相对于淀粉等物质来说,多糖含量相对较少，该实验板栗多糖的提取率仅为1.35%，说明板栗多糖含量不高，提取率偏低。但由于板栗比较常见，物美价廉,且恩施被誉为是“世界硒都”，所以用恩施市沙地乡富硒板栗为实验原料，研究富硒板栗对人体健康保健等方面具有重大的意义。 通过对板栗硒多糖的提取分离及硒含量等方面的研究，为硒多糖的近一步研究提供了理论和实践基础，本实验也有很多不足的地方，会在以后的学习生活中不断的学习不断的总结。

参考文献

[1]阮在新,魏天才.板栗的营养保健作用及其开发利用[J].农牧产品开发,1999,12(4):4-5.

[2]李润丰,常学东,陈雪娜,等.板栗多糖提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2011,31(2):96-100.

[3]吴永尧,彭振坤,陈建英,等.水稻对环境硒的富集和耐受能力研究[J].微量元素与健康研究,1999,16(4):42-44.

[4]朱明军.富硒小球藻食品的开发[J].郑州粮食学院学报,1999,20(3):77-80.

[5]何玲玲,王 新,王 娟,等.栗叶多糖的提取、鉴别及含量测定[J].中国酿造,2009,4(9):35-38.

[6]邵亭亭,张海晖,段玉清,等.亚临界水萃取板栗多糖及其清除自由基活性研究[J].食品科技,2012,37(12):156-160.

[7]Nakamura A,Furuta H,Katom,et al.Effect of soybean solublepolysaccharides on the stability of milk protein under acidic conditions.[J].Food Hydrocolloids,2003,17(8):333-343.

[8]陈吉生,吕建豪.超声波提取枸杞多糖工艺研究[J].今日药学,2009,13(12):35-37.

[9]曲晓兰,高红莉,段 瑞,等.超声波提取马齿苋多糖的研究[J].泰山医学院学报,2009,7(2):14-16.

[10]颜 辉,朱冬吉,吴 杰,等.超声波辅助提取蛹虫草多糖的研究[J].江苏农业科学,2009,8(1):66-68.

[11]卫生部.GB/T 5009.93-2010 食品安全国家标准、食品中硒的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.

[12]蒋步云,柴振林,吕爱华,等.杨梅中硒含量测定的消化方法[J].浙江农业食品科学,2012(8):l175-1176,1179.