过氧化氢在茉莉酸甲酯抑制拟南芥根生长中的作用研究

焦婵，师彦洁

(河南开封大学，河南 开封 475000)

茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(MeJA)是亚麻酸衍生的具有环戊酮基团的化合物。茉莉酸广泛分布于植物果实、花、种子、苗、胚芽、叶、茎、根尖等部位。大量的研究表明，茉莉酸类物质对植物生长有广泛的生理作用，归纳起来包括促进，抑制和诱导三个方面，促进呼吸作用、乙烯生物合成、气孔关闭、叶片脱落、过氧化氢酶活性等，抑制根的生长、幼苗生长、光合作用、种子花粉萌发等，诱导逆境蛋白、蛋白酶抑制剂、苯丙氨酸转氨酶等。并且发现茉莉酸类物质有类似脱落酸的效用，即在生理功能和代谢过程中起到激素的作用。研究表明，茉莉酸(酯)类物质可以作为内源信号分子与植物抗性密切相关，当植物受到机械伤害、干旱、低温、病虫害、低温等逆境时，植物体内的茉莉酸类化合物含量会迅速增加，进而诱导一系列与抗逆有关的基因表达，如苯丙氨酸转氨酶、蛋白酶的抑制剂等，使未受到伤害的部位及时抵抗不良的环境。

Gorbineau等(1988)在研究JAMe对向日葵种子萌发和幼苗生长的影响时发现10-5-10-3mol/L的JAMe可以显著的抑制初生根根长，而且浓度越高，抑制作用越大。Ravnikar等(1992)的实验结果也表明，外用不同浓度的JA可对马铃薯根系产生不同的影响，浓度高于10 μmol/L会对根系生长产生明显的抑制作用。刘或等试验发现,高浓度的M J处理，能使小麦根中过氧化物酶的活性提高，防止细胞壁的延伸,从而达到阻碍小麦生长的作用。

在光合生物产生氧气的同时，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)即作为副产物随之出现。生物体内的ROS包括超氧物阴离子(O2-)、H2O2、单线态氧(O21)及羟自由基(·OH)等,它们均具有较高的活性和毒性。正常情况下植物光合作用和呼吸作用产生的ROS水平较低，但很多胁迫包括干旱、盐害、冷害、重金属、紫外辐射、臭氧、机械伤害、营养缺乏、病原体入侵、高光强等均导致光合电子传递链及呼吸链产生过量ROS，还诱导NADPH氧化酶产生ROS，对细胞造成氧化毒害。H2O2是活性氧的一种，是细胞有氧代谢的产物。越来越多的实验证据表明，H2O2不仅具有损伤生物大分子产生细胞毒害性作用的能力，而且具有多种多样的生理功能。光、环境胁迫和植物激素ABA可以引起植物体内H2O2升高，而H2O2作为一个较早进化出来的信号分子，不仅在诱导氧化性光合作用中起了关键的作用，并且可以调节诸如气孔运动、超敏反应、细胞凋亡和基因表达等许多过程。细胞内H2O2浓度必须维持在一种精细平衡状态,它一方面可以通过质膜氧化还原系统和光呼吸系统产生，另一方面也存在完善的清除机制。总之,H2O2作为信号分子调控基因的表达,是一个十分有趣而值得探讨的问题。综上,H2O2作为植物的第二信使,已成为逆境生物学研究的重要课题,并且它作为信号分子的研究工作已取得了很大的进展。

植物拟南芥基因组存在10个NADPH氧化酶的同源基因,但是直到最近才证明这些基因在产生H2O2中的作用和功能，但其中只有C、D、F这3个基因在拟南芥根中表达，所以本实验借助于拟南芥这3个基因的突变体，研究MeJA在抑制根生长中的生物学机制。

1 实验材料与方法

1.1 材料。野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子经0.1 %升汞表面消毒5-6 min,用无菌水冲洗3-5次,将其点种于MS固体培养基上,用封口膜封好,在4 ℃下春化2-3天后,置于光照充足的培养室中.生长条件为:光/暗周期16/8 h，温度18-23 ℃,相对湿度80 %左右,光照强度90 μmol·m-2·s-1,昼夜温度分别为23±2 ℃，生长期间无任何胁迫。

1.2 MS培养基。(1)按比例从母液中吸取大量元素(50×)，微量元素(1000×)，铁盐(200×)，钙盐(50×)，有机物(100×)。(2)加入蔗糖(3%)。(3)调PH至6.0。(4)加入琼脂粉(0.6%)或(1.2%)。(5)高温高压灭菌(121 ℃，15 min)。(6)在超净工作台上将适量的MS培养基倒入已灭菌的洁净培养皿中。

1.3 不同浓度的JAMe处理。先配置MS固体培养基,在倒平板时分别向各个培养皿中加入不同浓度(0、0.5、5、50 μmol/L)的JAMe和无菌水(对照)，每个浓度各两个平皿，然后将野生型拟南芥(wt)和3种拟南芥过氧化氢酶突变体(C、D、F)的种子分别整齐得点于各个不同浓度的培养皿中,然后用封口膜封好，在4 ℃下春化2-3天后，置于光照充足的培养室培养3天。

1.4 测量根长。对各个JAMe不同浓度的培养皿中拟南芥的根长进行测量，并记录相关数据，连续测量7天，然后对每个培养皿的相关数据求其平均值及平行实验中的方差，并做出图表，比较不同浓度下根长的大小，进一步得出实验结论。

1.5 DAB染色

DAB：二胺基联苯胺

DAB溶液的配制：称取100 mgDAB于避光的有色瓶中，利用已经稀释的HCL溶液调节PH至3.8或其以下，用玻璃棒不断搅拌，在溶解过程中溶液的PH值不断升高，所以需要不时地调节pH值，使其充分溶解。

染色过程：取适量DAB染液，用NaOH调节pH值至5.8，然后分装于被锡箔纸包裹的EP管中，将拟南芥的幼苗放入其中，用锡箔纸包好后放置于28 ℃恒温箱中，避光染色8 h。

脱色过程：吸去DAB染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液体，加入无水乙醇1 ml，放置于沸水中至叶片绿色完全脱去

吸去液体，加入无水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

1.6 NBT染色

NBT：itroblue tetrazolium 氮蓝四唑

NBT染液的配制：称取1.1915 g Hepes，将其溶解于ddH2O中，定容至100 ml，然后调节pH值到7.6，用25 ml Hepes缓冲液(pH7.6)，并加入0.1 %TritonX-100配制成终浓度为0.1 mg/ml的溶液。

染色过程：取适量NBT染液，然后分装于被锡箔纸包裹的EP管中，将拟南芥的幼苗放入其中，用锡箔纸包好后放置于28 ℃恒温箱中，避光染色2 h。

脱色过程：吸去NBT染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液体，加入无水乙醇1 ml，放置于沸水中至叶片绿色完全脱去

吸去液体，加入无水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

2 结果分析

2.1 不同浓度的茉莉酸甲酯对野生型拟南芥(wt)根生长的影响

由图1可明显看出，与对照相比，外施不同浓度的茉莉酸甲酯(0.5、5、50 μmol/L)均可以抑制野生型拟南芥根的生长,且随着茉莉酸甲酯浓度的增加,根生长受抑制的程度也逐渐增大。

图1在茉莉酸甲酯的不同浓度下(0、0.5、5、50 μmol/L)野生型拟南芥(wt)的根6天的生长情况

2.2 茉莉酸甲酯对野生型拟南芥(wt)和突变体(C、D、F)根生长的影响

由图2数据统计结果可以看出茉莉酸甲酯不同浓度对野生型拟南芥(wt)和突变体(C、D、F)根生长的影响差异并不大。

图2拟南芥(C、wt、D、F)在不同浓度的茉莉酸甲酯(0、5、50 μmol/L)的作用下第七天的生长情况

2.3 DAB染色结果

未经茉莉酸甲酯处理和经过茉莉酸甲酯处理过的拟南芥在DAB染色后,根的染色结果差异并不大，所以可以认为H2O2在茉莉酸甲酯抑制拟南芥根生长的过程中在根部不发挥作用。

图3 DAB染色结果

2.4 NBT染色结果

未经茉莉酸甲酯处理和经过茉莉酸甲酯处理过的拟南芥在经过NBT染色后,根的染色结果差异并不大，所以可以认为H2O2在茉莉酸甲酯抑制拟南芥根生长的过程中不发挥作用。

图4 NBT染色结果

3 讨论

鉴于ABA与茉莉酸甲酯的功能相似性，已有的研究表明它们在执行功能时信号途径类似，如在诱导气孔关闭时都可以产生活性氧，所以我们关注在抑制根生长时它们的机制是否一致，由于有研究表明活性氧在ABA抑制根生长的过程中是发挥作用的，所以我们可以认为JAs和ABA抑制拟南芥根的生长机制是不同的。

参考文献：

[1] 吴文华,潘瑞炽.茉莉酸类物质的生物合成及其作用特点.植物学通报,1996,13(增刊):39-45

[2] 谷丽萍,周阮宝.茉莉酸在值物体内作用的研究进展[J].植物学通报,1997,14:31-35.

[3] 薛仁镐,金圣爱.茉莉酸甲酯：一种重要的植物信号转导分子.生物技术通报,2006,17:985-989.

[4] Corbineau F,Rudnicki RM,Come D.The Effects of methyl jasmonate on sunflower(Helianthus annuus L.)seed germination and seedling development.Plant Growth Regul,1988,7:157-169.

[5] Ravnikar M,Zel J,Plaper I,Spacapan A.Jasmonic acid.stimulates shoot and bulb formation of glarlic in vitro.Plant.Growth Regul,1994,12:73-77.

[6] Torres M A,Dangl J L,Jones J D G.Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:517-522.

[7] Gapper C,Dolan L.Control of plant development by reactive oxygen species.Plant Physiol,2006,141:341-345.

[8] Torres M.A,Onouchi H,Hamada S,Machida,Hammond-Kossack K.E.,Jones J.D.Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase(gp91phox).Plant J,1998,14:365-370.