金柚提取物对糖尿病肾病大鼠肾组织中p38MAPK炎症信号通路的影响

2018-05-23钟志华康战方

中国医学创新 2018年8期

钟志华　康战方

【摘要】目的：研究金柚提取物對糖尿病肾病大鼠肾组织中磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）及细胞核中核转录因子-κB P65（NF-κBP65）表达的影响。方法：采用一次性腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，分为正常对照组、糖尿病肾病模型组、阳性药物组（吗替麦考酚酯胶囊，11 mg/kg）、金柚提取物组（25、50 mg/kg），8周后测定各组大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白并留取肾组织。Western blot测定肾皮质中p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表达；酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清白细胞介素8（IL-8）、转化生长因子-β（TGF-β）、纤维连接蛋白（FN）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）等含量。结果：与正常对照组比较，糖尿病肾病模型组大鼠血清BUN、Scr含量，24 h尿蛋白，IL-8、TGF-β、FN、PAI-1水平、肾组织p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表达均显著升高（P<0.05）。经过治疗后，与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和金柚提取物组（25、50 mg/kg）大鼠血清中各指标含量及各蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。结论：金柚提取物对大鼠糖尿病肾病具有保护作用，其作用机制可能与调控肾脏组织中p38MAPK/NF-κBP65信号通路、减轻炎症反应有关。

【关键词】金柚提取物；糖尿病肾病；炎症

Effect of Extracts from Golden-pomelo on Expression of p38 Mitogen-activated Protein Kinase in Kidney of Diabetic Nephropathy Rats/ZHONG Zhihua，KANG Zhanfang.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：032-036

【Abstract】 Objective：To study the effect of extracts from golden-pomelo on expression of p38 mitogen-activated protein kinase（p-p38MAPK） and nuclear factor κB P65（NF-κB P65） in the kidney of diabetic nephropathy rats.Method：The diabetic rats were induced by a single intraperitoneal injection of Streptozotocin.The rats were randomly divided into normal control group，diabetic nephropathy model group，positive drug group and extracts from golden-pomelo treatment group.The blood urea nitrogen（BUN），serum creatinine（Scr） and 24 h urine protein of each group were measured.The content of p-p38MAPK and NF-κB P65 was determined by Western blot.The serum interleukin 8（IL-8），transforming growth factor-β（TGF-β），fibronectin（FN） and fibrinolytic enzyme activators inhibitor 1（PAI-1） were detected with the ELISA method.Result：Compared with the normal control group，BUN，Scr，24 h urine protein，IL-8，TGF-β，FN，PAI-1，p-p38MAPK and NF-κB P65 protein of the kidney in the diabetic nephropathy model group were obviously enhanced（P<0.05）.Compared with the diabetic nephropathy model group，BUN，Scr，24 h urine protein，IL-8，TGF-β，FN，PAI-1，p-p38MAPK and NF-κB P65 protein of the kidney in positive drug control group and extracts from golden-pomelo treatment group were significantly reduced（P<0.05）.Conclusion：The extracts from golden-pomelo can protect diabetic rats kidney possibly by regulation p38MAPK/NF-κB signaling pathway to anti-inflammatory mechanism.

【Key words】 Extracts from golden-pomelo； Diabetic nephropathy； Inflammatory

First-authors address：The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.008

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已成为终末期肾病的主要因素，而炎症的发病机制贯穿于整个DN的进展期[1-2]。炎症细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞等活化后在肾组织中浸润，产生多种炎症因子和介质，诱导启动多条炎症信号通路，导致级联式瀑布反应，引起肾组织加速损伤[3]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）信号通路及其下游核转录因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）被认为是DN肾组织炎症反应的经典途径，且已有多种中药复方或其提取物、单体可以通过抑制肾组织中p38MAPK信号通路调节炎症的过反应，调节炎症细胞平衡等，改善DN肾组织炎症损伤，延缓DN疾病进展[4-5]。本研究拟通过链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立DN大鼠模型，观察金柚提取物对肾组织中炎症信号通路的影响，探讨金柚提取物对DN的保护作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂金柚产自广东梅州，清水洗干净后切片，晾晒干燥后磨粉，过40目筛后，按照100 mg粉末∶95%乙醇1 mL比例超声30 min后，取得过滤液干燥后获得粉末待用。链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、尿蛋白、白细胞介素8（IL-8）、转化生长因子-β（TGF-β）、纤维连接蛋白（FN）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）均购买自南京建成生物有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体p-p38MAPK、NF-κB P65购自美国Santa Crun公司；全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自北京博奥森生物公司；化学发光液和硝酸纤维素膜购自美国Santa Crun公司；链脲佐菌素（STZ）干粉购自美国Sigma公司。

1.2 主要仪器血糖仪（罗氏公司）；3500化学凝胶成像系统、Power-pac200电泳仪（美国BIO-RAD公司）；倒置显微镜（德国Leica公司）；Infinite M2000 Pro多功能酶标仪（瑞士）；FJ-2000高速分散匀质器（常州）；超低温冰箱（美国Thermo公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 实验动物 SD雄性大鼠，购自暨南大学医学实验动物中心，体重160～180 g，动物生产许可证号：SCXK（广）2008-0009。大鼠适应性喂养1周，温度（23±2）℃，湿度50%～70%，动物造模前禁食12 h，进水自由。该实验符合动物伦理学要求。

1.4 方法

1.4.1 动物模型的建立采用单次腹腔注射高剂量STZ（65 mg/kg）诱导1型糖尿病大鼠及DN模型。动物适应性喂养一周后，糖尿病肾病模型组或糖尿病肾病模型+药物组一次性腹腔注射STZ 65 mg/kg（溶解于0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液中，pH值为4.5）。正常对照组注射柠檬酸缓冲液。STZ注射后第3天和第7天尾静脉采血测血糖值，连续两次血糖值≥16.7 mmol/L确定为造模成功。

1.4.2 分组与给药将造模成功的大鼠按照随机数表法分为糖尿病肾病模型组，阳性药物组（吗替麦考酚酯胶囊，上海罗氏制药有限公司，国药准字H20031240，11 mg/kg，生理盐水配置成11 mg/mL），金柚提取物组（25、50 mg/kg，将金柚提取物用生理盐水配置成10 mg/mL），每组8～9只。10只正常大鼠作为正常对照组。注射STZ一周后开始给药。所有大鼠每日早晨灌胃一次，模型组和对照组按照体重给予等体积的生理盐水。

1.4.3 标本的采集与处理给药7周后用代谢笼收集每个大鼠的24 h尿液，用于测定尿白蛋白。给药8周后处理动物，麻醉后心脏采血10 mL，3000 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃保存直至进一步实验。血液中BUN、Scr、IL-8、TGF-β、FN、PAI-1的检测及24 h尿白蛋白测量均按照商业试剂盒步骤进行。取肾皮质保存于-80 ℃保存直至进一步实验。

1.4.4 Western blot法检测肾组织中p-p38MAPK和胞核中NF-κB P65蛋白的表达每组选取3只动物检测肾组织p-p38MAPK和胞核中NF-κB P65蛋白的表达。严格按照试剂盒操作步骤提取组织中蛋白含量，并经BCA试剂盒定量，-80 ℃冰箱保存待用。蛋白样品加5×上样缓冲液煮沸5 min冷却，开始SDS-PAGE。商业化10% SDS-PAGE分离胶，插入梳齿后，孔中加入变性蛋白10 μL，左侧Marker加样孔中加5 μL的Marker。稳压120 V电泳，将电泳盒放入冷水浴中，溴酚蓝至分离胶下缘1 cm左右时，结束电泳。制作三明治，转膜槽放入预冷的缓冲液中，恒压100 V转膜1.5 h。取出PVDF膜在牛奶封闭液中4 ℃孵育4 h。小鼠抗大鼠单克隆抗体p-p38MAPK、NF-κB P65一抗（1∶1 000）稀释液，与PVDF膜4 ℃摇床孵育过夜。4 ℃预冷PBS洗液冲洗6次，每次10 min，辣根酶标记山羊抗大鼠二抗（1∶10 000）稀释，常温与PVDF 膜孵育2 h后，冲洗3次，每次10 min。将发光液滴在PVDF膜上，将膜放入预热的凝胶成像系统检测。用目的蛋白的灰度值与内参（β-action）的灰度值的比值表示，并進行统计学分析。

1.5 统计学处理采用破解SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，符合正态分布组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察与对照组大鼠比较，糖尿病肾病模型组大鼠出现典型的“三多一少”症状，毛色色泽暗淡、精神萎靡，活动较少，随着病程加重，体重进行性降低；经吗替麦考酚酯胶囊及金柚提取物治疗后，上述症状均好转。

2.2 各组大鼠血清中BUN、Scr、24 h尿蛋白比较与正常对照组比较，糖尿病肾病模型组大鼠血清中BUN、Scr、24 h尿蛋白含量均显著升高（P<0.05）；与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和金柚提取物组均能显著降低大鼠血清BUN、Scr、24 h尿蛋白含量（P<0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1比较与正常对照组比较，糖尿病肾病模型组大鼠血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1含量均显著升高（P<0.05）；与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和金柚提取物组均能显著降低血清中IL-8、TGF-β、FN、PAI-1的含量（P<0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠肾组织中p-p38MAPK比较与正常对照组比较，糖尿病肾病模型组大鼠肾组织中p-p38MAPK表达水平显著升高（P<0.05）；与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和金柚提取物组均能显著降低肾组织中p-p38MAPK表达水平（P<0.05）。见图1和表3。

2.5 各组大鼠肾组织细胞核中NF-κB P65比较与正常对照组比较，糖尿病肾病模型组大鼠肾组织细胞核中NF-κB P65表达水平显著升高（P<0.05）；与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和金柚提取物组均能显著降低肾组织细胞核中NF-κB P65表达水平（P<0.05）。见图1和表3。

3 讨论

DN是糖尿病患者严重的并发症，一旦出现持续性蛋白尿，如不及时逆转，则可能导致肾功能衰竭，只能采用透析治疗[7-8]。已有许多研究表明，炎症反应在DN的疾病进展中发挥重要角色，因此如何寻找有效的抗炎药物治疗对逆转DN尤为重要[9-10]。

p38MAPK参与正常免疫和炎症反应，参与巨噬细胞、嗜中性粒细胞的功能性反应，通过趋化现象、颗粒胞外分泌、粘附及凋亡等调控T细胞的分化和凋亡[11-12]。糖尿病状态下，p38MAPK在肾脏被激活，参与肾脏组织的炎症反应及凋亡[13]。p38MAPK可以调控多种炎症细胞因子的转录。NF-κB作为丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）信号通路下游的核转录因子，当细胞受到外界信号（如脂多糖、特异的细胞因子）刺激时，引起一系列连锁的酶促反应，促使下游IκB-α发生磷酸化而与NF-κB解离，NF-κB激活而移位进入细胞内，与DNA上相应位点结合来发挥生物学效应[14-15]。NF-κB作为多种炎症信号通路的最终汇合点，对于发现药物作用靶点带来一点的难度。NF-κB可以促进IL-8、TGF-β、FN及PAI-1等炎症介质的合成与释放，进一步激活免疫细胞释放肿瘤坏死因子，血小板衍化生长因子等细胞因子及分泌细胞外基质加剧炎症反应，导致纤维连接蛋白FN导致肾小球硬化[16-17]。因此，能否成功干预p38MAPK/NF-κB信号通路成为治疗DN的重要手段。

现代药理学发现金柚中富含多种黄酮类化合物，具有抗炎、调节血糖血脂等功能，对预防和治疗糖尿病、肥胖以及心脑血管方面的疾病有重要作用[18-20]。笔者前期的体外研究表明，金柚提取物能特异性激活雌激素受体β[1]。而雌激素受体β能调节炎症信号通路。本研究笔者进一步在体内探讨金柚提取物对STZ诱导的1型糖尿病大鼠肾病模型中的保护作用，尤其是对肾组织中炎症反应通路的调控作用。本研究结果表明，经过治疗后，与糖尿病肾病模型组比较，阳性药物组和不同浓度金柚提取物组（25、50 mg/kg）均能显著降低大鼠血清BUN、Scr及24 h尿蛋白含量（P<0.05）。同时，药物治疗组血清中IL-8、TGF-β、FN及PAI-1水平亦均显著降低（P<0.05）。Western blot显示肾组织中p-p38MAPK及胞核中NF-κB P65蛋白表达均下调（P<0.05）。

综上所述，金柚提取物对DN大鼠肾脏具有保护作用，其机制可能与调控肾脏组织中p38MAPK/NF-κB P65信号通路，减轻炎症反应有关。

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