MSCT全肿瘤灌注参数与结直肠癌临床病理分期及MVD、EGFR水平的相关性分析

杨璧　潘恒　蔡勇

【摘要】 目的：探討多层螺旋CT（MSCT）全肿瘤灌注参数与结直肠癌临床病理分期及肿瘤微血管密度（MVD）、表皮生长因子受体（EGFR）表达水平的相关性。方法：选取2014-2017年在本院就诊且进行MSCT全肿瘤灌注的42例结直肠癌患者为研究对象，记录患者灌注参数[血容量（BV）、血流量（BF）、达峰时间（TTP）、表面通透性（PS）]，根据病理诊断结果患者进行临床病理分期，并按照免疫组化步骤检测肿瘤样本中MVD及EGFR表达情况，采用Person相关性分析或Spearman相关性分析检测灌注参数与其他指标的相关性。结果：根据病理结果，TNM Ⅰ期6例、Ⅱ期7例、Ⅲ期14例、Ⅳ期15例；且TNM分期与BF、TTP、PS均具有一定相关性（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035）；此外MVD及EGFR与以上各参数均无明显相关性（P>0.05），但MVD与EGFR之间存在一定相关性（r=0.433，P=0.043），同时EGFR阴性组与阳性组BF、TTS表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：MSCT全肿瘤灌注参数与临床病理分期具有较好的相关性，而MVD及EGFR的相关性较差，因而较适宜作为临床病理特征分析的辅助指标。

【关键词】 全肿瘤灌注； 结直肠癌； 血管生成

Correlation Analysis of MSCT Whole Tumor Perfusion Parameters with Clinicopathologic Stage and MVDD and EGFR Levels in Colorectal Cancer/YANG Bi，PAN Heng，CAI Yong.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：009-013

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between the perfusion parameters of multislice CT（MSCT） and clinical stage，colorectal cancer，microvessel density（MVD） and epidermal growth factor receptor（EGFR） expression in colorectal cancer.Method：From 2014 to 2017，42 patients with colorectal cancer treated with MSCT whole tumor perfusion were selected as study subjects.The perfusion parameters[blood volume（BV），blood flow（BF），peak to time（TTP） and surface permeability（PS）] were recorded.The expression of MVD and EGFR in tumor samples were detected according to the immunohistochemical method.The correlation between perfusion parameters and other indexes were analyzed by Person correlation analysis or Spearman correlation analysis.Result：According to the pathological results，there were 6 cases in TNM stage Ⅰ，7 cases in TNM stage Ⅱ，14 cases in TNM stage Ⅲ and 15 cases in TNM stage Ⅳ.There was a certain correlation between TNM stage and BF，TTP，PS（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），in addition，there was no significant correlation between MVD and EGFR with the above parameters（P>0.05），but there was a correlation between MVD and EGFR（r=0.433，P=0.043）.Meanwhile，the difference between EGFR negative group and positive group was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The correlation between MSCT whole tumor perfusion and clinicopathologic stage is better than that between MVD and EGFR，so MVD and EGFR are more suitable for an auxiliary index for clinical pathological analysis.

【Key words】 Whole tumor perfusion； Colorectal cancer； Angiogenesis

First-authors address：Xinyi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyi 525300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.003

目前，结直肠癌是我国消化道肿瘤中发生率及死亡率均较高的恶性肿瘤之一[1-2]。随着对肿瘤微环境的深入研究发现，人们发现肿瘤新生血管的生成是导致结直肠癌患者发生肿瘤增殖及转移的重要因素之一，而给予患者抗血管生成药物治疗后，患者生存率有明显提高[3-4]。因此，对于可反应肿瘤血管生成能力指标如肿瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）或表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等水平的检测越来越受到医务科研人员的重视[5-7]。而得益于多层螺旋CT（multislice CT，MSCT）灌注成像技术快速发展，使过大医务工作者可以间接了解患者机体肿瘤血供及血管生成情况。但是，如何将灌注参数与肿瘤血管生成能力及患者预后情况结合起来一直是研究的重点及热点问题。因此，本文对42例在本院就诊且实施MSCT全肿瘤灌注的结直肠癌患者临床资料进行分析，并结合其临床病理分期和MVD、EGFR水平，以期望能对MSCT技术的高效应用提供有力证据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月-2017年9月在本院胃肠外科接受结肠镜检查，并经病理确诊的42例结直肠癌患者临床资料。纳入标准：（1）经病理诊断确诊为结直肠腺癌；（2）MSCT全肿瘤灌注前未采取抗肿瘤治疗；（3）无肝、肾、心等重要脏器病变；（4）不合并其他慢性消耗性疾病；（5）完成手术，且有完备的随访资料。排除标准：（1）预计生存期小于6个月者；（2）患者躁动，无法配合检查者。本研究经本院伦理委员会批准，所有参与研究的患者知情并签署知情同意书。

1.2 CT检查

1.2.1 扫描前准备 检查前6 h禁食，清空肠道。检查前10～15 min肌肉注射盐酸消旋山崀菪碱（批准文号：H41023400，生产厂家：国药集团容生制药有限公司）10 mg。经Foleys导尿管从肛门注入生理盐水，至患者略感不适时停止，1 000～1 500 mL。上检查床后，要求患者采取平静呼吸，并用腹带辅助抑制患者腹式呼吸。

1.2.2 灌注方法及相关参数 患者取仰卧位，采用64层CT扫描机（德国 Siemens）对腹盆部进行CT平扫，选择病变最大层面为灌注区域，进行Jog模式下的全肿瘤灌注扫描。按6 mL/s流速经患者肘前静脉注入碘普罗胺注射液（批准文号：H20030506，生产厂家：Bayer Schering Pharma AG）50 mL，延迟10 s后即可开启灌注扫描模式，持续时间60 s，管电压100 kV，管电流100 mA。

1.2.3 图像分析及处理 扫描图像均传至Siemens工作站（德国 Siemens），由两名影像医师应用Body Perfusion软件自带的Tumor Perfusion程序处理及分析扫描图像。选择感兴趣区时压避开血管及肿瘤边缘区、肿瘤坏死区。灌注图像由Siemens工作站中Tumor Perfusion软件采用是非去卷积算法计算灌注各参数。所有图像均显示为彩色，并以多次测量后取平均值为该病最终灌注参数数值。软件生成的灌注参数值：（1）血容量（blood volume，BV），反映肿瘤组织血管生成情况，单位mL/100 g；（2）血流量（blood flow，BF），反映单位时间流经肿瘤组织血管中的血量，单位mL/（min·100 g）；（3）达峰时间（time to peak，TTP），反映癌组织内部灌注压力，单位s；（4）表面通透性（permeability surface area product，PS），反映单位时间内，对比剂由从组织毛细血管扩散至细胞间隙的传输速率，单位mL/（min·100 g）。

1.3 临床病理分级 依据病理结果及参考文献[8]进行TNM分期。T0：未见原发肿瘤灶；T1：肿瘤仅见于黏膜、黏膜下层；T2：肿瘤浸润至肌层；T3肿瘤浸润至直肠周围脂肪组织；T4：肿瘤侵犯其他器官。N0：无区域性淋巴转移；N1：1～3个区域性淋巴结转移；N2：存在4个以上的区域性淋巴结转移。M0：无远处转移，M1：存在远处转移。

1.4 标本采集及免疫组化检查 手术切除患者肿瘤组织后，在肿瘤近端处1～2 cm多点取材，经10%福尔马林溶液固定后，按照常规步骤进行石蜡包埋，并切成厚度为5 μm切片。按照免疫组化试剂盒步骤测定MVD数量和EGFR表达量。以被CD34染色成孤立的棕黄色内皮细胞或内皮细胞团认为1个微血管，先以低倍镜选择微血管数量最多区域后，转换至高倍镜下，随机挑选10个视野，所得均值即为MVD值。EGFR染色依据参考文献[9]评分标准：A为染色细胞占视野下总细胞数比例。按照细胞染色比例<1%（0分），1%～10%（1分），11%～50%（2分），51%～80%（3分），>80%（4分）；B为细胞染色强度，按照阴性（0分），弱阳性（1分），阳性（2分），强阳性（3分）。最后得分依据A×B得分计算，总分0分（-），1～4分（+），5～8分（++），9～12分（+++）。其中将（-）、（+）视为阴性表达，（++）、（+++）视为阳性表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计分析软件处理数据。计量资料按照（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。灌流参数与临床病理分期、MVD、EGFR相关性分析采用Person相关性检验或Spearman相关性检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般資料 42例结直肠癌患者，男28例，女14例；平均年龄（62.4±10.3）岁；肿瘤位置：乙状结肠6例、升结肠5例、横结肠2例、降结肠3例、直肠26例。

2.2 临床病理特征与灌流参数相关性分析 病理结果显示，42例患者中处于Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期15例。由相关性分析结果可知，BF、TTS、PS与肿瘤TNM存在一定相关性（rBF=

-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），即灌流参数BF数值越低、TTP与PS值越高，患者TNM分期则越高，同时BV与肿瘤TNM分期无明显相关性（rBV=-0.134，P=0.432），见表1。

2.3 MVD与灌流参数相关性分析 低倍镜下清晰可见被染成棕黄色或棕褐色内皮细胞或内皮细胞簇，在200倍镜下观察，42例结直肠癌患者MVD平均为（30.13±8.45），但由于所选切面差异，部分微血管结构并不明显，可呈管腔状。经Person相关性分析可知，MVD与全肿瘤灌注参数BV、BF、TTP、PS均无相关性（r=0.187，P=0.245；r=0.292，P=0.085；r=-0.146，P=0.314；r=-0.152，P=0.218），见图1。

2.4 EGFR与灌流参数相关性 免疫组化结果显示，共18例为阴性，24例为阳性，见图2。此外，相关性结果显示，EGFR与BV、BF、TTP及PS均未有明显的相关性（r=0.194、0312、-0.188、-0.238，P=0.312、0.363、0.294、0.324），但EGFR与MVD呈现一定成相关性（r=0.433，P=0.043）。同时，EGFR阴性组与阳性组BF、TTP、MVD比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

结直肠癌是我国较为常见且复发率较高的消化道肿瘤之一。目前研究已证实，肿瘤新生血管为结直肠癌的复发及转移提供了必要的条件，而这同样是造成肿瘤难以根治的主要原因。因此，采取一种快速、准确的评价指标来预测肿瘤新生血管能力具有重要意义。其中，MVD正是反映肿瘤新生血管生成能力的重要参数之一。其主要方法为通过免疫组化法检测手术切除后肿瘤组织中的MVD值，并以此来推测肿瘤内血管生成能力。该方法虽然在一定程度上反映了局部肿瘤血管生成能力，但由于取材部位、染色方法、计数误差等，往往存在重复性差的问题，从而对最终结果的判断造成影响。与此同时，随着医疗技术的快速发展，采用MSCT全肿瘤灌注来评估术前肿瘤血管生成能力已逐渐被临床工作者认同。García Figueiras等[10]曾对24例结直肠癌患者全灌注参数及MVD值进行相关性分析，其结果显示两者间存在一定的相关性。但随后Cros等[11]则提出全灌注参数与MVD并无明显相关性，但却能对肿瘤临床分期具有一定预测作用。笔者猜测，造成两种不同结果的原因，除了所筛选的病例数差异外，更为重要的是肿瘤内血管生成存在不均一性，而这导致了MVD并不能很好的反应肿瘤组织整个血管生成情况，因而无法与全灌注参数进行系统比较。

本文通过增大病例数，即将病例数增多至42例，除了比较患者临床分期与灌流参数相信外，还采用特异性较强的CD34抗体染色肿瘤血管后计算MVD值。此外，本研究还增加了对EGFR的检测。以往研究证实EGFR可通过与配体结合促发下游级联信号通路，如PI3K-Akt及RAS-RAF-MAPK通路，并最终参与细胞增殖、分化、迁移及细胞损伤一系列过程[12-14]。此外，大量研究报道称在结直肠癌患者癌组织中存在EGFR高表达，且EGFR具有促进血管生成及抑制细胞凋亡的作用[15-16]。因此，通过以上各指标分析，有助于進一步了解全肿瘤灌流与血管生成的相关性。

本研究结果显示，灌流参数中BF、TTP、PS与肿瘤TNM存在相关性（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），而BV则与肿瘤TNM分期无相关性。而对TNM分期各指标进一步研究发现，无论肿瘤浸润程度，是否发生淋巴结转移及是否有远处转移，其灌流参数中的BV均未见明显差异，而当肿瘤分期靠后，出现淋巴结转移或远端转移时，其BF下降、TTP及PS均增殖。其结果基本与Fraioli等[17]相符合。由于分期较晚的肿瘤患者，其内部可供肿瘤生存空间有限，组织内压力增加，使得毛细血管受压，减慢了血流速度，从而延长了达峰时间。此外，由于血流量不足与肿瘤高度耗氧的矛盾存在，使肿瘤细胞具有更好的侵袭及转移能力[18]。

此外，本文进一步确认了全肿瘤灌注参数与MVD之间并无显著相关性。可能原因是肿瘤组织内血管分布相对失衡，并具有一定的向心性递减趋势；同时，全肿瘤灌注成像较适用于分析成熟血管状况，但对于孤立的或未成熟的血管无法有效鉴别[19]。而CD34抗体则可对新生血管，未成熟血管等进行标记染色，从而导致数据有一定偏差。此外，本文发现虽然EGFR与全肿瘤灌注参数无明显相关性，但EGFR阴性组与EGFR阳性组在BF及TTP平均值上存在差异。目前，作为胃肠道肿瘤进展及耐药的关键分子，EGRF已成为时下较为有效的药物靶点。研究显示EGRF除了参与调控细胞周期外，还可以通过调节VEGF、Ang-1等因子水平来影响肿瘤血管的生成[20]。而笔者发现，EGFR与MVD存在一定的相关性。而这可能是EGFR同样存在于未成熟内皮细胞及新生血管附近，从而在数据采集上与MVD基本一致。

综上所述，MSCT全肿瘤灌注与结直肠癌TNM临床病理分期具有较好的相关性，可作为预测临床病理特征的有效指标，但MSCT全肿瘤灌注与MVD及EGFR相关性较弱。但鉴于本次纳入病例数较少，且缺乏中长期随访结果，因此若要获得更为确切可靠结论，仍需进一步扩大样本，并增加术后随访。

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（收稿日期：2017-12-22） （本文编辑：程旭然）