星点设计—效应面法优选疱毒清洗液提取工艺的研究

2018-05-23罗宇东钟江谭安蔷方刚

中国医药导报 2018年7期

罗宇东钟江谭安蔷方刚

[摘要] 目的优化疱毒清洗液提取工艺并进行质量控制。方法采用星点设计-效应面法，以疱毒清水提液中没食子酸及野黄芩苷含量为代表性指标，考查煎煮时间、加水量、提取次数三个因素对提取效果的影响，再经中试生产验证，筛选出疱毒清洗液最佳的水提工艺。结果疱毒清洗液最佳水提工艺为加10倍量水，煎煮提取2次，每次125 min。结论星点设计-效应面法优选的提取工艺重现性好，质量稳定，可作为疱毒清洗液的提取工艺。

[关键词] 疱毒清洗液；星点设计-效应面法；提取工艺；没食子酸；野黄芩苷

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0027-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Paoduqinq Lotion and to control its quality. Methods Through central composite design and response surface methodology， using gallic acid and scutellarin content as the indicators， the effects of the amount of water， extraction time， extraction frequency on water extraction process were investigated. The best water extraction process of Paoduqinq Lotion was obtained and varified by pilot scale test. Results The best water extraction process of Paoduqinq Lotion was performed by extracting the decoction with 10 times the amount of water twice， 125 min each time. Conclusion The optimized extraction process with good reproducibility and stable quality can be used as the extraction process of blister lotion.

[Key words] Paoduqinq Lotion； Central composite design and response surface methodology； Extraction process； Gallic acid； Scutellarin

皰毒清洗液是广西中医药大学第一附属医院拟研发的广西民族药医疗机构制剂，该产品根据壮医临床验方研制而成，以过塘蛇、半枝莲为主药，临床治疗带状疱疹有很好的效果，可有效缩短病程，减少患者痛苦，不留后遗症，尤其在对预防带状疱疹后遗神经痛方面有独特的作用[1]。本研究采用星点设计-效应面法，以没食子酸及野黄芩苷含量为代表性指标并进行多指标综合评价，优化考察疱毒清洗液提取工艺并进行质量控制，为其产品的规模化生产提供理论支撑。

1 仪器与材料

岛津LC-2030C 3D高效液相色谱仪，岛津色谱工作站；岛津C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；超声清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司SG250HE型）；UV-2500分光光度计（日本岛津）；METTLERAM100电子天平。

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110831-201604）；野黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110739-2016）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

各药材均购自南宁市友和古城大药房，经广西中医药大学制药厂质量保证部鉴定。

2 方法与结果

2.1 产品工艺设计

本产品处方是由民间验方整理而来，经医院临床使用疗效显著。本产品处方一直沿用药材水煮浓缩后得到的洗剂剂型。由于洗剂制备简单易行，溶媒来源广，吸收迅速，显效快，本研究在剂型选择上沿用原来洗剂的剂型，在药效不变的情况下达到方便患者的目的。因此，本产品工艺设计为药材经过水煮、浓缩、过滤后，加入适当的稳定剂及防腐剂而制成洗剂，达到去粗取精的目的。

2.2 因素水平的确定

一般传统的水提工艺考查因素主要包括煎煮加水量、煎煮时间、煎煮次数、药材的粉碎度四要素。由于药材粉碎度对中药材水提的影响程度前人已经做过许多研究，药用部位为全草类的药材切段后或者使用已制成饮片的药材直接水提即能达到理想的浸提效果，所以在此次工艺考查中未将药材粉碎度作为考查的因素。本实验的工艺主要考查煎煮加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素。

由于提取次数为非连续变量，实际操作较为困难，故将提取次数确定为2次，选择加水倍数及提取时间为自变量。根据星点设计的原理，采用2因素5水平试验，水平用代码值-α、-1、0、1、α来表示，因素水平见表1[2-8]。

2.3 试验方法

2.3.1 提取液的制备

按处方比例精密称取过塘蛇、半枝莲等药材，按表2进行提取，将提取液浓缩并定容至100 mL，即得药材提取液。

2.3.2 没食子酸的含量测定

2.3.2.1 供试品溶液的制备精密吸取提取液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度溶解，混匀，取10 mL进行离心，再取上清液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，作为供试品溶液。

2.3.2.2 对照品溶液的制备称取没食子酸对照品适量，加甲醇制成1 mg/mL对照品溶液。

2.3.2.3 含量测定将对照品溶液和供试品溶液分别注入LC-2030C 3D高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱，岛津C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相，甲醇-0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）；检测波长，270 nm；流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL；柱温：室温。理论塔板数按没食子酸计算应不少于5000。

2.3.3 野黄芩苷的含量测定

2.3.3.1 供试品溶液的制备精密吸取提取液1.00 mL，蒸干，精密加入甲醇50 mL，称重，超声1 h，补足甲醇损失重量，过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。

2.3.3.2 对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷4 mg，加甲醇制成50 mL（每1 mL含野黄芩苷80 μg）。

2.3.3.3 含量测定将对照品溶液和供试品溶液分别注入LC-2030C 3D高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱为C-18甲基硅烷柱；流动相为甲醇∶冰醋酸溶液（1→41）（40∶60）；检测波长335 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL，柱温为室温。理论塔板数按野黄芩苷计算应不少于1500。

2.4 数据处理

将表2中的没食子酸、野黄芩苷的数值标准化为0～1间的归一值（d，desirability），d=（Yi-Ymin）/（Ymax- Ymin），并将归一值求加权算术几何平均数，得加权总评归一值（OD，overall desirability）。OD = d10.5d20.5，结果见表2。

2.5 响应面分析结果

将表2中数据运用Design-Expert 8.0.5b软件进行响应面分析，以OD值（Y）为响应值分别对各因素进行多元线性和二项式拟合，模型的好坏通过复相关系数进行判定。多元线性模型拟合方程如下：Y = -0.757 92+0.060 518A+0.009 087 46B（R2 = 0.8409）；二次多项式模型拟合方程如下：Y = -3.317 33+0.504 77A+0.024 658B-0.000 214 286AB-0.023 609A2-0.000 075 786 6 B2（R2 = 0.9507）。两者比较可知，二次多项式模型拟合方程的相关系数明显高于多元线性模型拟合方程的相关系数，说明该提取工艺各项指标采用二次多项式方程拟合更为恰当，故选择二次多项式拟合方程优选工艺参数。并对模型采用F检验进行方差分析，结果见表3。由表3可知，各因素对提取液中没食子酸、野黄芩苷含量影响的主次顺序为B>A，二次多项式模型达极显著水平，说明该方程与实际情况拟合度良好，且相对于多元线性拟合的R2有所提高，可信度及预测性更好，可利用该模型分析预测最佳工艺条件。

2.6 工艺参数优化和预测

根据上述拟合二次多项式模型，绘制因变量随自变量变化的二维等高图和三维效应面图，见图1。通过等高线图，可知提取较佳的工艺范围：A，8.69～11.37倍；B，124.79～132 min。综合考虑生产成本及操作可控性，该试验选取的最佳提取工艺应：加10倍量水煎煮提取2次，每次125 min。

2.7 验证实验

取处方中各药材，按照最佳工艺条件进行提取，即加10倍量水煎煮提取2次，每次125 min。测定其提取液中没食子酸、野黄芩苷的含量，计算OD值，结果为0.9897；按照拟合方程计算得到的预测值结果（0.9997）偏差1.14%，表明优选的提取工艺预测性良好，所选工艺条件重现性好，结果见表4。

3 讨论

疱毒清洗液中过塘蛇为方中主药，过塘蛇为豆科植物，根茎具有祛风除湿、活血通络的功效，主治风湿痹痛、跌打损伤、腰肌劳损、四肢麻木。现代药理学研究表明，过塘蛇具有抗氧化、解毒消肿、保肝护肝、对肿瘤细胞的抑制和抗炎作用；过塘蛇的主要活性成分类型有酚性成分、黄酮类、氨基酸、糖类等成分，其中没食子酸为其代表性成分之一[9-14]。处方中另一味主药为半枝莲，半枝莲性辛，微苦，性凉，归肺、肝、肾经，具有清热解毒、化瘀止血、利水消肿等功效。现代研究表明，半枝莲的主要活性成分为黄酮类和二萜类化合物，亦含有生物碱、甾体、多糖等成分，其中野黄芩苷为黄酮类化合物的代表性成分[15-20]。中成药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中成药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成分的含量测定方法将成为中成药未来质量控制方法的主流。因此，本试验以没食子酸及野黄芩苷含量为代表性指标考察制剂的提取工艺比较全面、合理。

课题组前期对疱毒清洗液过塘蛇所含的没食子酸含量测定进行了方法学考察，采用HPLC法，没食子酸进样量在0.162～0.810 μg范围内与峰面积线性关系良好（r = 0.9997），平均回收率为100.06 %，RSD = 1.87 %（n = 6），测定10批疱毒清洗液样品中没食子酸的平均含量为15.65 mg/g（RSD = 0.55 %）。色谱条件选择时，用甲醇-0.1%磷酸作为流动相，各成分分离效果较好，经全波长扫描，发现最大吸收波长为270 nm；另外，疱毒清洗液半枝莲中野黄芩苷含量的测定也进行了方法学考察，采用高效液相色谱法，结果野黄芩苷进样量在0.125～0.80 μg范围内，进样量与吸收峰面积呈线性关系。平均回收率为97.6%（RSD = 1.0%，n = 5）。测定10批疱毒清洗液样品中的野黄芩苷平均含量为4.13 mg/mL（RSD = 1.20%）。流動相为甲醇∶冰醋酸溶液（1→41）（40∶60），检测波长335 nm，各成分分离效果较好。可见，以上测定疱毒清洗液水提液中没食子酸及野黄芩苷含量的方法可用于其提取工艺的优化研究。

正交设计、均匀设计、星点设计-效应面优化法为近年来在药学领域中应用最广泛的三种设计和优化法，可用于中药提取、炮制、制粒、处方筛选等诸多方面。三种设计方法各有优缺点及使用范围。星点设计-效应面法在中药提取优化研究方面具有显著的优势，主要为试验次数较少，试验精度高，并适用于多因素、多水平的试验，相比正交设计法更简化，比均匀设计法更全面[3-8]。因此，本文采用星点设计-效应面优化法优化疱毒清洗液提取工艺，优化后的工艺稳定可控，重现性好，适用于实际生产。

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