活性氧簇对干细胞更新和分化影响的研究进展

曹义娟，徐惠，权斌，胡方方，刘小燕，杨亚茹

(东南大学医学院附属徐州医院/徐州市中心医院 1.生殖医学中心，2.胃肠外科，江苏 徐州 221009)

干细胞是药物筛选、疾病模型、组织工程的重要研究工具。由于间充质干细胞(MSCs)的分化能力和生物活性，MSCs被用于评估抗凋亡、抗炎症、抗瘢痕因子分泌作用。多能干细胞(PSCs)包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)。人ESCs能够分化为成年组织的任何细胞类型，包括精原干细胞(SSCs)，尽管睾丸中SSCs数量很少，但它们经历自我更新分裂和分化后可产生许多精子，SSCs自我更新机制还不十分清楚[1]。肿瘤干细胞(CSCs)具有正常干细胞相似的特性，与肿瘤的启动、治疗抵抗、肿瘤复发、血管生成和转移有密切的关系。

1 ROS的产生和清除

1.1 ROS的产生

1.2 ROS的清除

过度内源性ROS、ROS和抗氧化蛋白之间的失衡、细胞外来源的高水平ROS能够引起不可逆的核酸、脂肪、氨基酸、糖的过氧化作用，引起细胞衰老、凋亡、转化，触发系列病理过程。干细胞为了阻止ROS的过度积聚，产生多种类型清除剂。清除系统包括过氧化物歧化酶(SOD1、SOD2、SOD3)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶、还原谷胱甘肽(GSH)、硫氧还原蛋白(TRX)、硫氧还原蛋白还原酶(TRXR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)[5]。维生素C和维生素E在抗氧化物酶系统也起着重要作用。半胱氨酸在空气中可氧化为胱氨酸，胱氨酸通过胱氨酸运输机(XCT)运送至胞浆，然后胱氨酸转变为半胱氨酸，以维持GPX合成。在氧化应激(OS)情况下，Nrf- 2(XCT调节剂)导致XCT表达增多，引发GPX生产增多。

MSCs表达相当水平XCT、CAT、GPX、SOD的活性形式[6]。PSCs拥有复杂系统保护细胞免受OS损伤，以确保遗传稳定性。多能性转录因子正相调节SOD2表达，在干细胞分化期间抗氧化能力减弱[7]。PSCs表达大量Nrf- 2，它在自发分化过程中下调，PSCs通常培养在滋养层上，滋养层为GPX表达提供足够数量的半胱氨酸。在OS情况下ESCs Nrf- 2增加，它与TRXR、GPX- 1、GPX- 4表达增加有关。CSCs呈现低能量代谢速度，与非肿瘤CSCs相比产生较少ROS，它们通过组合机制来获得，如：(a)上调ROS清除剂，(b)下调ROS产生酶，(c)促进糖酵解，(d)减少线粒体质量，(e)低氧消耗。

2 ROS对干细胞的影响及其信号通路

2.1 低剂量ROS是干细胞自我更新的第二信使

低剂量ROS通过激活(ERK)1/2和JUN- 1/2 通路，增强MSCs 增殖和迁移。各种温和ROS诱导剂激活miR- 210,从而激活MSCs的ERK1/2和AKT通路[8]。温和水平ROS调节MSCs的分泌功能。低氧诱导的ROS通过促进VEGF分泌，参与MSCs促血管生成功能。NOX2催化产生的ROS诱导神经干细胞(NSCs)的增殖。低水平ROS通过激活MAPK、NFKB、Wnt通路调节PSCs增殖, 通过激活MAPK、PI3K/AKT通路上调IGFBP3表达，抑制MSCs生骨分化[9]。ESCs遗传稳定性需基础水准的ROS。ESCs抗菌功能受到NOX- 2表达的调控。GSC表达NOX1、NOX3和NOX4，NOX1产生的ROS通过激活P38MAPK和JNK通路负责维持GSC增殖，ROS在Ras信号通路下游发挥作用，30 μM H2O2促进体外GSC生长[10]。理想剂量维生素C加入到公山羊SSCs中体外培养，通过维持适量ROS的产生增强抗凋亡基因BCL- 2的表达，减少凋亡基因Bax、P53的表达，从而促进公山羊SSCs的体外增殖。SSCs自我更新受到不同NOX基因连续的激活，显示了ROS对 SSCs自我更新增殖调节的复杂性，NOX1 在增殖稳定期间主要表达，NOX3 删除减少了培养精原细胞和新鲜分离睾丸细胞中SSCs数目[3]。

2.2 高水平ROS损伤正常干细胞动态平衡的信号通路

OS通过减少TRF1、TRF2的表达减少MSCs端粒长度，导致细胞不可逆衰老,其中包括绝经后骨质疏松[11]。MSCs可分化为心脏组织，恶劣缺血微环境状态引起的高水平ROS通过下调FAK、src、integrin表达，上调MAPK、JNK、ATM、P53表达水平，下调抗凋亡蛋白BCL- 2，促使移植MSCs凋亡, 减少新血管生成[12]。PSCs具有高水平抗氧化物酶，可防止细胞核和线粒体DNA损伤，具有自我防护作用，OS损伤较少，H2O2短期处理iPSCs后，部分抗氧化基因表达上调可能是iPSCs对抗OS的一种保护机制。高浓度ROS减少SSCs数目[13]。OS通过激活JNK和P53，诱导ESCs细胞周期停滞。高水平ROS瓦解线粒体心磷脂- 细胞色素C复合物，释放细胞色素C，另外，ROS诱导BAX- BAK二聚体形成，在线粒体膜形成通道，促进细胞色素C易位至胞浆，胞浆细胞色素C激活caspases 9和3表达而导致凋亡。Nrf- 2缺失的男性精子产生系统与年龄相关。SOD1基因敲除小鼠精原细胞显示对热应激较差的抵抗性。ROS发挥第二信使作用或OS来源的阈值还需进一步探讨。

2.3 CSCs内ROS依赖的信号通路及转录因子

在肿瘤细胞内糖酵解至少取代部分氧化磷酸化产生ATP,以适应低氧代谢，有较少线粒体缺陷和ROS产生。CSCs类似于正常干细胞，是静态慢周期细胞，其缓慢分裂可能引起ROS的水平低于通常癌细胞。

在CSCs内PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路通过调节FOXOs从而调节MnSOD和过氧化物酶的产生,减弱NOX4表达，以清除ROS[14]。HIF- 1α被干细胞所处的低氧环境所激活。在胶质瘤干细胞内，HIF- 1α通过激活Notch通路正向调节AKT，然后上调ROS清除酶。另外，ROS也能够刺激Notch信号通路，以便维持CSCs。CD44+/CD24-肿瘤干细胞与乳腺癌其他细胞亚群相比，ATM表达明显增高，CD24表达消除与其增殖速度减慢、较低ROS水平和遗传稳定有关[15]。P- ERK在人CD133+肝癌细胞高于CD133-细胞，较低ROS水平与ERK激活有关。PrxⅡ通过VEGFR- 2/STAT3信号通路上调Bmi1和Sox2，从而调节VEGF驱动的CSCs[16]。

3 ROS调节干细胞自我更新和分化平衡

未加调控的ROS是有害的，调控ROS的产生可调节细胞功能，如细胞增殖、分化、生存和凋亡。ROS产生和细胞抗氧化系统中和的微妙平衡，对调节干细胞的命运起着重要的作用。

3.1 MSCs

MSCs具有自我更新和多能分化能力，有复杂和丰富的高抗氧化能力，有可能成为治疗OS相关的病理组织损伤的理想手段。MSCs与分化细胞类型相比，对OS更为敏感[17]。大多数移植的MSCs经受OS，只有那些离氧源少于300 μm的细胞能够生存。许多信号通路决定了MSCs的最终命运，其中包括Wnt、FOXO、Hedgehog，这些通路调节生脂和骨生成，其中关键因素是一群Wnt基因家族蛋白质。研究表明OS、成骨分化和脂形成之间存在联系，ROS的增加抑制MSCs增殖、增强凋亡、增强生脂、减少生骨分化，生骨刺激抑制生脂，反之亦然[18]。MSCs分化为成骨细胞需要代谢开关从糖酵解转向增强线粒体呼吸，以确保足够能量供给来完成这个过程，线粒体代谢增加，细胞内ROS水平提升诱导FOXO3磷酸化、核转位和FOXO3活力下调，抵抗调节MSCs分化的Wnt信号通路，减弱成骨分化，为此抗氧化剂对预防骨质疏松起着重要作用[19]。Wnt/β- catenin是生脂/生骨分化分子开关，信号通路通过减少c/EBPα和PPARγ促进生骨，抑制生脂，β- catenin是诱导生骨起始的必要信号，其条件性失活转化成骨细胞为软骨细胞和推迟骨骼矿化，此通路是抗骨质疏松药物筛选的重要作用靶点。Wnt信号通路功能性结果与氧化还原参与的网络相似，Wnt与氧化还原信号通路交叉影响[20]。紧密调节ROS水平对MSC末端分化很重要，然而ROS准确来源、位点、水平、确切类别还有待确定。

3.2 PSCs

PSCs具有高水平ROS清除蛋白表达，为此显示低水平ROS。PSCs和终极分化干细胞之间能量代谢和氧化还原状态之间存在很大差异。在增殖阶段，ESCs表达高水平糖酵解酶，线粒体消耗少量氧，而分化的ESCs显示较低酵解酶通量。哺乳动物大多数类型只有2%～9%氧，低氧水平(<5%)有利于维持ESCs多能性，控制ESCs发育，阻止自发性hESCs分化，HIFs参与此过程，HIFs能够调节正常组织局部低氧转录效应，调节参与干细胞自我更新的多能性转录因子的表达，低氧可推动分化的hESCs返回到干细胞状态。氧化还原平衡是ESCs干细胞性重要决定因素，在神经形成过程中 Prx1和oct4 以相互依赖方式表达，Prx通过抑制ROS/JNK信号通路保护ESCs干细胞性。依赖Atg3的自我吞噬参与线粒体动态平衡调节，对维持多能性起着关键性作用[21]。

线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅱ参与心肌细胞分化，在分化细胞中线粒体和氧化磷酸化增多，导致ROS产生增多。 ROS对干细胞分化起着重要作用，然而其机制仍然还不清楚。NOX2催化产生的ROS通过激活NOTCH信号通路促进miPSCs分化为内皮细胞，增强移植miPSCs来源内皮细胞血管生成能力[22]。CD38信号通路通过调节ROS的产生参与mESCs神经分化，H2O2应用能够缓解CD38敲除对ESCs分化的抑制作用。ROS通过上调许多心肌相关转录因子的表达增强ESCs的心肌分化。hESCs能够分化为SSCs，初级、二级精母细胞和单倍体精子细胞。精子存在于低氧环境，OS能够负面影响精子生成，为了确保男性生殖细胞正确繁殖，睾丸内细胞显示广泛机制来调控OS，精细胞线粒体抗氧化物酶失调、丢失或过度表达均可破坏正常动态平衡，导致男性不育[23]。

3.3 ROS对iPSCs重新编程的影响

体细胞通过过度表达Yamanaka因子成功重新编程为iPSCs，用类似方法也可改编肿瘤细胞为诱导肿瘤干细胞(iCSCs)[24]。理解ROS对iPSCs的效应，对正确维持iPSCs多能性、特定细胞系直接分化以应用于临床很重要。iPSCs和iCSCs均具有ESCs特性，改编能减少其抗氧化防御，而分化趋向于减弱抗氧化酶的表达，增强对ROS的敏感性。iPSC和hESCs线粒体DNA减少与P53丢失有关。低氧诱导剂刺激或P53通路抑制可增强改编效率，当氧化体细胞改编为糖酵解多能细胞时，代谢改变发生在改编过程早期，HIF- 1α和HIF- 2α参与此变化，低氧能够增强成纤维细胞改变为iPSCs，iPSCs有高的致癌潜能， c- Myc是肿瘤基因，non- c- Myc iPSC有能力分化为肝细胞(iPSC- Heps)，小鼠移植non- c- Myc iPSC 6个月未有肿瘤形成。加入抗氧化剂维生素C可增加重新编程效率[25]。

总之，ROS对调节干细胞更新、分化和重新编程起着重要的作用。而ROS的阈值、调控干细胞命运的清除蛋白表达的调控仍需进一步探讨。

4 ROS调控是许多临床疾病的重要治疗靶点

4.1 ROS是许多年龄相关疾病的治疗靶点

OS是疾病和死亡的一个主要原因，如肿瘤、心血管并发症、急性和慢性炎症、神经组织退化疾病[26]。当ROS水平达到半致死剂量，细胞进入衰老状态。衰老与OS增加有关, OS提供了神经降解的基础，神经元和神经胶质细胞与其他组织相比对OS更敏感。NRF2是抵抗各种应激的一个关键细胞保护通路，男性精子产生系统NRF- 2缺乏与年龄相关。SOD1基因敲除小鼠精原细胞显示对热应激抵抗性较差。ATM基因敲除小鼠精子停止产生，同时伴随精原细胞ROS水平增加，减数分裂前生殖细胞丢失。OS参与年龄相关的黄斑部退化，视网膜色素上皮产生大量ROS，年龄增加导致失去处理过多ROS的能力。NRF2催化剂Ai- 1是抵抗氧化挑战的有效化合物，NRF2催化剂对视网膜色素上皮细胞株显示保护效应，在OS情况下Ai- 1驱动NRF2效应分子起到部分激动剂的作用。NRF2失调与恶性肿瘤有关, 恢复NRF2激活的生理水平治疗试剂是治疗ROS相关疾病比较好的药物[27]。X连锁慢性肉芽肿病(X- CGD)是由NOX2基因突变引起的遗传性免疫系统疾病，其吞噬细胞NOXs产生的ROS不足以杀死微生物，从而引发威胁生命的细菌和真菌感染。矫正过的X- CGD iPSC骨髓分化导致NOX2表达上调35倍，到达类似健康细胞水平，重新组建产生的ROS对此细胞疾病可进行功能性矫正[28]。在梗死心脏MSCs移植时通过共同注射抗氧化剂NAC减少ROS诱导的细胞- 基质粘连，可增强其移植成功可能性。

4.2 OS增强是肿瘤治疗的手段

近年来，采用合适药物促进ROS的产生或使细胞抗氧化系统失效，诱导ROS参与的癌细胞损伤被认为是杀死肿瘤细胞的根本治疗策略，化学治疗、辐射能够增加细胞内ROS水平。放射疗法主要依赖于ROS，它引起的线粒体功能异常、NOX上调可导致持久的OS。照射后肿瘤复发是由于优先激活DNA损伤检验点、增强DNA修复能力和抗氧化防御。CSCs比非CSCs放射敏感性更强,对质子照射敏感性高于光子照射敏感性[29]。对CSCs内ROS的研究可能开启以CSCs为靶标的肿瘤放射治疗增敏的途径，而CSCs内独特的氧化还原平衡及保护CSCs免受ROS参与的细胞杀死机制还没有完全弄清楚。

CSCs标记物抑制剂与ROS诱导组合治疗容易成功，这些化学药物可增强抵抗性CSCs对低剂量照射敏感性，根除CSCs和整个肿瘤、抑制PI3K/AKT/mTOR通路，组合治疗与每一个单独治疗相比更能够增强ROS的产生，随后激活P53，通过上调Bax、下调Bcl- 2，释放线粒体细胞色素C，激活caspase，切割PARP，激发自吞，最终导致凋亡[30]。ROS也是肿瘤发生和进展的中心贡献者，抗氧化剂通过去除ROS和恢复氧化还原平衡阻止癌变，抗氧化添加剂除了肿瘤预防作用外，它在化疗中还起到降低剂量毒性作用。

5 总 结

生理水平ROS调节干细胞增殖、生存和分化的不同信号通路，发挥第二信使的功能，对调节干细胞命运起着重要的作用。高水平的ROS通过诱导OS对干细胞产生毒性影响，而ROS产生的特殊位点、不同ROS类型的检测及其功能性差异还需进一步研究。另外，ROS作为干细胞调节剂作用或损伤分子的阈值水平还不清楚。氧化还原状态对干细胞的调控能够引发干细胞控制性的增殖和分化，为此有着广泛的生物医学应用前景和改进肿瘤治疗的潜力。

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