siRNA沉默FoxO1对STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜IL- 1β的影响及其作用机制

廖洪霞，魏艳丽，朱晓燕，叶剑，周琦，吕红彬

(1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所 眼科，重庆 400042； 2.西南医科大学附属医院 眼科，四川 泸州 646000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的并发症之一，也是工业化国家人民致盲的首要病因[1- 2]。尽管激光光凝、玻璃体切除术等眼科治疗技术明显改善了患者的预后，但是血糖精准控制的难度、部分患者对治疗不敏感等原因导致DR患者数量依然居高不下。因此，探讨DR的发生机制对提高治疗效果、改善患者预后具有重要意义。白细胞介素- 1β(interleukin- 1β, IL- 1β)参与早期的炎症反应，并调节细胞的凋亡、变性等过程。有研究[3]显示,DR大鼠模型的血浆、玻璃体和视网膜IL- 1β表达明显增加，IL- 1β持续升高又会反馈性诱导视网膜炎症扩大。叉头状转录因子O1(forkhead transcription factor O1, FoxO1)是叉头状转录因子O家族蛋白中最早被发现的成员，既往研究[4]称DM大鼠视网膜组织中FoxO1表达增加，且FoxO1表达与炎症反应和凋亡的增加呈正相关。但是在DR的发生和进展中，FoxO1、IL- 1β之间的调控机制依然不清楚。本研究利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术干扰DM大鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞中的FoxO1表达，旨在探讨FoxO1对IL- 1β的影响及可能的调控机制，现将研究成果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物来源

原代人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，细胞加入内皮细胞生长完全培养基，培养箱中37 ℃、5%CO2培养，隔日更换1次培养基。

60只SPF级Sprague- Dawley大鼠购自第三军医大学实验动物中心，大鼠8周龄，均为雄性，体重(200±20)g。大鼠于12 h光照/12 h黑暗条件下饲养，适应性喂养1周后开始实验。本研究大鼠的使用、喂养和操作均严格遵守科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。

1.2 实验试剂

内皮细胞生长完全培养基(Gibco公司，美国)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)，SYBR Green master mix(Exiqon公司，丹麦)，BCA蛋白定量试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，FoxO1 miRNA慢病毒载体及阴性对照组(si- FoxO1，上海吉凯基因化学技术有限公司)，胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)，Total RNA提取试剂(日本TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，辣根过氧化物酶标记的二抗(Earthox公司，美国)，4,6- 二脒基- 2- 苯基吲哚(DAPI，罗氏公司，瑞士)，鼠抗大鼠GAPDH抗体(Sigma公司，美国)，鼠抗人IL- 1β抗体(Sigma公司，美国)，鼠抗人P38、p- P38抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，鼠抗人JNK、p- JNK抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，鼠抗人ERK、p- ERK抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，鼠抗人FoxO1抗体(Sigma公司，美国)。

1.3 实验仪器

流式细胞仪(BD公司，美国)，倒置荧光显微镜(奥林巴斯公司，日本)，Real time- PCR仪(ABI公司，美国)，电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞分组与处理 本研究前期委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成si- FoxO1及相应的阴性对照(NC- FoxO1)，并构建至pGLV3- GFP慢病毒穿梭质粒中，si- FoxO1序列为5′- TCTGTCCGTACACAGVAAG- 3′，NC- FoxO1序列为5′- TTCTCGGAAGCTGTCACGT- 3′。HRCECs按照处理方式分为空白对照组(Mock组)、阴性对照组(NC- FoxO1组)和si- FoxO1组(si- FoxO1组)3组。取对数生长期的HRCECs细胞，以1×104个·孔-1接种于96孔板，用全培养基将转染腺病毒稀释为6×108TU·ml-1，分别向每孔加入100 μl上述稀释病毒，置于CO2培养箱中常规培养，72 h后倒置显微镜下观察GFP的表达情况。取对数生长期细胞接种于6孔板中，待细胞70%融合后分别加入含5、15、25、35 mmol·L-1葡萄糖的培养基继续培养24 h，采用RT- PCR和Western blot检测各组细胞FoxO1、IL- 1β表达。

1.4.2 DM大鼠分组及模型建立 60只大鼠随机分为对照组(Control组)、DM组、si- FoxO1转染组(LV- si- FoxO1组)和空病毒转染组(LV- NC组)4组，每组15只。DM组、LV- si- FoxO1组、LV- NC组建立DM大鼠模型。造模前大鼠禁食12 h，自由饮水，分别向大鼠腹腔注射60 mg·kg-11%STZ溶液，Control组大鼠注射等体积生理盐水，72 h后取尾静脉血检测血糖，以连续3次尾部血糖≥16.7 mmol·L-1作为DM大鼠成模标准。造模成功后腹腔注射戊巴比妥钠3 ml·kg-1麻醉大鼠，滴加托比卡胺滴眼液扩瞳，用29 G针头抽取10 μl 慢病毒载体溶液(Control组、DM组不注射，LV- si- FoxO1组注射si- FoxO1溶液，LV- NC组注射空载体病毒溶液)，以45°从角巩膜缘进针，注射完毕后局部涂抹左氧氟沙星预防感染。

1.4.3 标本采集 腺病毒注射12周后腹腔注射戊巴比妥钠3 ml·kg-1麻醉，完全麻醉后仰卧位固定于动物实验台。将大鼠眼球完整剥离后分为两部分，一部分用4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇洗脱，石蜡包埋，用于免疫组化染色。另外一部分新鲜眼球组织用手术剪剪成2 mm×2 mm小块状后立即置于液氮保存，用于后续RT- PCR和Western blot检测。

1.4.4 免疫组织化学染色检测样本FoxO1、IL- 1β表达 取组织切片，脱蜡和水化后PBS冲洗3次，高压锅水浴法修复组织抗原，滴加3%H2O2室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次。滴加100 μl FoxO1或IL- 1β抗体，4 ℃孵育过夜，第2天PBS冲洗3次，再滴加1～2滴二抗，室温孵育40 min，PBS冲洗后滴加DAB染液，苏木精复染，HCl分化，自来水反复冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4.5 RT- PCR检测FoxO1、IL- 1β mRNA表达 取处理后的细胞，弃去培养基，加入胰蛋白酶消化，PBS冲洗，加入1 ml Total RNA提取试剂提取总RNA。取40 mg 眼球组织置于EP管中，加入Total RNA提取试剂振荡提取总RNA。按照逆转录反应试剂说明书将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，FoxO1上游为5′- GGCTGAGGGTTAGTGAGCA- 3′，下游为5′- AGGGAGTTGGTGAAAGACATC- 3′；IL- 1β上游为5′- AGGGCAGAATCATGAGCAAGT- 3′，下游为5′- AGGGTCTGCATTGGATGGCA- 3′；GAPDH上游为5′- CACCATTGGCAATGAGGGGTTC- 3′，下游为5′- AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT- 3′。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，总计40个循环。定量分析结果以Ct值表示，以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.4.6 Western blot检测FoxO1、IL- 1β、p- P38、p- JNK、p- ERK蛋白表达 收集对数生长期细胞，或将眼球组织切片研磨粉碎，加入1 ml RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白纯度。将50 μg蛋白提取液置于10% SDS- PAGE电泳分离，常规湿法转膜，加入5%脱脂牛奶孵育封闭2 h。分别加入相应一抗：FoxO1(1∶200)、IL- 1β(1∶200)、P38(1∶100)、p- P38(1∶100)、JNK(1∶500)、p- JNK(1∶500)、ERK(1∶200)、p- ERK(1∶200)、GAPDH(1∶100)，4 ℃孵育24 h。再滴加二抗37 ℃孵育2 h。PBS冲洗3次，用ECL化学发光显影试剂盒显影，以GAPDH作为内参照，扫描目的条带和内参条带，使用Image J软件对条带进行分析，计算目的条带相对表达量。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 7.0软件对数据进行处理，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高糖环境诱导HRCECs FoxO1、IL- 1β表达增加

与5 mmol·L-1葡萄糖浓度组比较，15 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL- 1β mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，25 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL- 1β mRNA和蛋白表达明显高于5 mmol·L-1浓度组，而35 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL- 1β mRNA和蛋白表达增加的更明显，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，说明葡萄糖以浓度依赖性的方式诱导HRCECs FoxO1、IL- 1β表达增加，见图1。

与5 mmol·L-1浓度组比较，*P<0.05，**P<0.05

A.RT- PCR检测HRMECs FoxO1、IL- 1β mRNA表达；B.Western blot检测HRMECs FoxO1、IL- 1β蛋白表达

图1高糖诱导HRCECsFoxO1、IL-1β表达

2.2 si- FoxO1抑制HRCECs IL- 1β表达

NC- FoxO1、si- FoxO1转染72 h后倒置荧光显微镜下观察，NC- FoxO1、si- FoxO1组可见大量GFP表达，而Mock组仅见少量GFP表达(图2A)，说明慢病毒载体呈稳定、高效转染。RT- PCR和Western blot检测结果显示，si- FoxO1组FoxO1 mRNA和蛋白表达明显低于NC- FoxO1组和Mock组(P<0.05)，证实si- FoxO1转染细胞模型建立成功。与NC- FoxO1组比较，si- FoxO1组IL- 1β mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)，NC- FoxO1组和Mock组IL- 1β mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2B～C。

与NC- FoxO1组比较，**P<0.05

A．倒置荧光显微镜观察转染后细胞GFP表达；B.RT- PCR检测转染后细胞FoxO1、IL- 1β mRNA表达；C.Western blot检测转染后细胞FoxO1、IL- 1β蛋白表达

图2si-FoxO1慢病毒转染后对FoxO1、IL-1β表达的影响

2.3 免疫组化染色检测大鼠视网膜FoxO1、IL- 1β表达

免疫组化染色结果显示，DM组大鼠FoxO1阳性染色主要分布于神经节细胞层、内网状层，IL- 1β阳性染色细胞分布于视网膜全层。与Control组和LV- si- FoxO1组比较，DM、LV- NC组FoxO1、IL- 1β表达明显增加(P<0.05)；LV- NC组与Control组FoxO1、IL- 1β表达差异无统计学意义(P>0.05)，DM组和LV- NC组FoxO1、IL- 1β表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4 si- FoxO1抑制大鼠视网膜IL- 1β表达

DM组和LV- NC组FoxO1、IL- 1β mRNA和蛋白表达明显高于Control组和LV- si- FoxO1组(P<0.05)，LV- NC组与Control组FoxO1、IL- 1β表达差异无统计学意义(P>0.05)，DM组和LV- NC组FoxO1、IL- 1β表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.5 FoxO1通过MARK信号通路调节IL- 1β表达

si- FoxO1组p- P38、p- JNK、p- ERK蛋白表达明显低于NC- FoxO1组和Mock组(P<0.05)，NC- FoxO1组和Mock组p- P38、p- JNK、p- ERK蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图3免疫组化染色检测大鼠视网膜FoxO1、IL-1β表达×200

与Control组比较，**P<0.05；与LV- NC组比较，##P<0.05

A.RT- PCR检测大鼠视网膜FoxO1、IL- 1β mRNA表达；B.Western blot检测大鼠视网膜FoxO1、IL- 1β蛋白表达

图4si-FoxO1抑制大鼠视网膜IL-1β表达

3 讨 论

DR是DM最常见的微血管并发症，目前研究[5- 6]证实黏附分子、炎症因子和趋化因子等与DR的发病和进展密切相关。在DM患者和DR大鼠模型的视网膜、玻璃体及血浆中，促炎因子IL- 1β及下游靶基因Caspase- 1表达明显上调[7]，提示IL- 1β可能参与了DR的发病。本研究显示葡萄糖以浓度依赖性的方式诱导HRCECs IL- 1β表达增加，提示高血糖能够诱导IL- 1β表达升高，进而参与视网膜病变的进程。与TNF- α不同，IL- 1β虽然不能杀死细胞，但是可以诱导细胞凋亡[8]。有研究[9]显示，向大鼠玻璃体内注射IL- 1β可以引起视网膜微血管细胞凋亡，导致视网膜出现组织病理改变。FoxO1可以调节多种细胞分化、增殖、自噬和氧化应激，也是DR早期炎症激活的主要诱导因素。Battiprolu等[10]报道称1型和2型DM大鼠视网膜中FoxO1活性增加，同时伴有炎症反应增强和视网膜细胞凋亡增加。本研究在体外实验中发现，随着葡萄糖浓度升高HRMECs FoxO1表达逐渐增加，说明高血糖环境也可以激活FoxO1的活性。

与NC- FoxO1组比较，**P<0.05

A.Western blot检测转染后细胞MAPK通路相关蛋白电泳图；B.Western blot检测转染后细胞p- P38蛋白表达；C.Western blot检测转染后细胞p- JNK蛋白表达；D.Western blot检测转染后细胞p- ERK蛋白表达

图5si-FoxO1慢病毒转染后对MAPK通路相关蛋白表达的影响

既往有报道[11]证实FoxO1可以调控IL- 1β表达，但是在视网膜内皮细胞中是否存在相似情况依然未见报道。本研究利用siRNA技术干扰HRMECs FoxO1表达，结果显示si- FoxO1组IL- 1β mRNA和蛋白表达明显低于NC- FoxO1组和Mock组，说明抑制FoxO1可以降低视网膜内皮细胞IL- 1β表达，从而降低视网膜微血管炎症反应。Wang等[12]也证实,FoxO1与靶基因的辅阻遏物或共活化剂直接结合调节IL- 1β的转录。国外一项最新研究[13]显示，FoxO1与IL- 1β启动子结合促进IL- 1β受体表达增加和炎症反应的放大。另外一项研究[14]称，在大鼠肝细胞中IL- 1β与相应的受体结合诱导细胞质和细胞核内FoxO1过表达，提示FoxO1调控IL- 1β表达可能起到类似正反馈的作用。本研究进一步建立DM大鼠模型，通过动物模型验证FoxO1在体内对IL- 1β的调控作用。首先根据Huang等[15]报道的方法，向DM大鼠模型的玻璃体腔注射LV- si- FoxO1下调FoxO1的表达，免疫组化显示FoxO1阳性染色主要分布于神经节细胞层、内网状层，IL- 1β阳性染色细胞分布于视网膜全层，这与Xu等[16]报道结论一致。RT- PCR和Western blot检测结果显示，LV- si- FoxO1组FoxO1、IL- 1β mRNA和蛋白表达明显低于DM组和LV- NC组，说明在DM大鼠视网膜中FoxO1亦参与了IL- 1β的表达。

虽然通过体外和体内实验均证实了抑制FoxO1可以下调IL- 1β的表达，但是FoxO1调控IL- 1β的机制依然少见报道。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)[17]属于丝蛋白/苏氨酸激酶，也是调控基因表达、细胞增殖和凋亡的重要信号通路。P38、JNK、ERK是MAPK家族重要成员，其中P38、JNK可被氧化应激、高糖环境等诱导活化，而ERK则主要参与细胞的凋亡。李永浩等[18]证实MAPK、晚期糖基化终末产物均参与了DM视网膜血管功能的损伤。刁雪红等[19]对2型DM小鼠模型动脉内皮细胞进行研究，结果显示模型组、阴性对照组P38、JNK、ERK蛋白表达差异无统计学意义，但是模型组p- P38、p- JNK、p- ERK蛋白表达明显高于阴性对照组，提示MAPK磷酸化改变参与了DM所致血管内皮功能失调。本研究显示si- FoxO1组p- P38、p- JNK、p- ERK蛋白表达明显低于NC- FoxO1组和Mock组，提示抑制FoxO1表达可能是通过降低MAPK磷酸化下调IL- 1β表达。Khan等[20]报道称,高糖干预视网膜内皮细胞，MAPK信号通路的关键蛋白(P38、JNK、ERK)磷酸化表达增加，抑制MAPK信号通路可以抑制DR和其他DM并发症的早期病变。

综上所述，高糖能够诱导HRCECs FoxO1、IL- 1β表达增加，抑制FoxO1表达可能是通过降低MAPK磷酸化下调IL- 1β表达，FoxO1有望成为DR治疗的潜在分子靶点之一。

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