牛肌肉生长抑制素基因突变的遗传效应与育种应用

魏著英, 白春玲, 李光鹏

内蒙古大学生命科学学院, 省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室, 呼和浩特 010071

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族成员。MSTN主要在骨骼肌中表达，并分泌到细胞外间隙，通过血液循环运输到各组织器官从而起调节作用。MSTN不仅与骨骼肌的生长发育直接相关，而且参与糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢等生理活动的调节[1, 2]。MSTN基因在不同物种中具有极强的进化保守性，说明该基因在动物生长发育与躯体模式形成中具有重要作用。同时，MSTN基因在同一物种中还具有较多的突变多态性。如果该基因发生突变，那么动物的表型将发生显著变化，出现肌肉过度发育或肌肉发达现象。本文将对牛的MSTN基因突变类型、突变后遗传效应及肉牛育种应用等作重点阐述，以期为牛MSTN基因的相关研究提供参考，为我国地方品种牛的改良和选育提供理论支持。

1 MSTN基因的保守性

对于MSTN基因的认识，是从发现了牛的双肌表型(double muscling)开始的。1807年，英国人Cuelly首次记录了牛的双肌表型；1888年，Kaiser对这种牛的表型做了较为清楚的记录；1929年，Wriedt认为这种表型是由单因子(单基因)控制的；1934年，Kronacher等提出该表型由三因子(tri-factorial)调控；1971年，Quesada与Cachafeiro又提出牛的双肌性状由双因子调控[3,4]；直到1997年，才鉴定出MSTN基因与双肌臀表型相关[5]，该基因定位于牛基因组的2号染色体[6]。利用人工突变技术使小鼠的MSTN基因发生突变，突变小鼠也表现出肌肉发达的双肌表型[5,7]，由此将MSTN基因称为抑制肌肉发育基因(抑肌基因)。

研究发现，MSTN基因对于维持动物躯体性状和肌肉结构发挥重要调节作用[8]。MSTN基因在牛、羊、兔、狗、人、鱼、猪、鸡、狒狒、斑马鱼等不同物种间高度保守，其C端序列的同源性>90%[5]。小鼠、大鼠、人、猪、鸡与火鸡的同源性为100%；狒狒、牛、绵羊仅有1～3 bp的差别；斑马鱼与上述物种的同源性为88%[5]。除在牛中发现MSTN基因突变引起肌肉肥大外，在小鼠[9]、羊[10]、狗[11]和人[12]中也发现了自然突变的个例。

2 牛MSTN基因结构与有义突变类型

2.1 牛MSTN基因结构

牛MSTN基因位于2号染色体的2q11，包含3个外显子和2个内含子。外显子1和外显子2的长度分别为506 bp和374 bp，外显子3的长度随着poly(A)长度的不同而有所不同(1 701 bp、1 812 bp或1 887 bp)；内含子分别是1 840 bp和2 033 bp(图1)。

图1 牛MSTN基因的结构示意图Fig.1 The diagram of the bovine MSTN gene.

牛MSTN基因序列仅有一个转录起始位点，在转录起始密码子ATG上游133 bp处，其cDNA只有一个阅读框(ORF)，翻译376个氨基酸。MSTN蛋白具有TGF-β超家族的典型特征，是一种分泌型多肽，其前体蛋白N端为疏水的信号肽；C端是包含9个保守的半胱氨酸的成熟肽，中间区段为前肽。在前肽和成熟肽之间有一个RSRR蛋白酶解位点，酶切释放出26 kDa的成熟肽，成熟肽与特异性受体结合从而发挥生物学功能[13]。

2.2 牛MSTN有义突变类型

到目前为止，不同品种牛的MSTN基因中发现了至少6个功能性突变位点，包括比利时蓝牛(Belgian blue cattle)、皮尔蒙特牛(Peidmontese)、夏洛莱牛(Charolais)、阿奎坦牛(Blonde d’Aquitaine)、利木赞牛(Limousin)和德国黄牛(German gelbvieh)。比利时蓝牛由英国短角牛(English shorthorns)与荷兰牛(Dutch friesians)杂交，并与比利时本地牛杂交选育而成。比利时蓝牛的MSTN基因在nt821～831的位置发生了11个碱基的缺失，导致275位、276位和277位的3个氨基酸的丢失，阅读框从274位开始移位，使终止子提前到287位点[13]。皮尔蒙特牛的MSTN基因的第三外显子区的nt938 bp发生了G→A突变，致使氨基酸序列中313位的半胱氨酸突变为酪氨酸(C313Y)，该突变发生于TGF-β超家族极度保守的9个半胱氨酸的第5个半胱氨酸。对发生于美国多家牛场的皮尔蒙特双肌牛检测发现，发生突变的牛均为nt938 bp的G→A突变，并且均为纯合子突变[13](图2)。夏洛莱牛的MSTN第二外显子的nt238 bp由C突变为T，导致氨基酸序列第204位Q(谷氨酰胺)突变为X(终止密码子)，产生终止子[14]。利木赞牛MSTN的第一外显子nt282 bp处发生了C→A的突变，导致氨基酸序列第94位由F(苯丙氨酸)突变为L(亮氨酸)[15]。阿奎坦牛的MSTN基因第二内含子的nt1234 bp处发生了T→G的突变，导致第三外显子前多出了41 bp，氨基酸序列移码突变并终止，缺失第三外显子编码的氨基酸[16]。德国黄牛在MSTN第一外显子的nt191 bp由T突变为C，导致氨基酸序列第64位由L(亮氨酸)突变为P(脯氨酸)，使蛋白结构发生改变[17]。

这些发生于不同品种牛的MSTN基因突变，均改变了分泌蛋白的结构，使MSTN蛋白失去活性，解除了MSTN基因对肌肉发育的抑制作用，由此导致肌肉发达的双肌表型。

分析牛MSTN基因核苷酸多态性可以发现，该基因除上述具有功能的突变外，还发现了多个无义突变。如图3所示，在第一和第二外显子、第一和第二内含子中均存在无义突变，说明MSTN基因是一个易发突变的基因。也说明该基因虽然在物种之间存在较强的保守性，但在具体物种(如牛)不同个体中发生突变的可能性极高。比较特别的是第三外显子中没有无义突变的报道，说明第三外显子的保守性较强，突变后对机体的影响更明显。如果发生了有义突变，则改变了肌肉发育表型；如果发生了无义突变，对生长发育没有影响。

图2 牛MSTN基因的有义突变位点示意图Fig.2 The diagram of the sense mutation in bovine MSTN gene.

图3 牛MSTN基因的无义突变位点示意图[18]Fig.3 The diagram of the nonsense mutation in bovine MSTN gene[18].

3 中国地方品种牛MSTN基因突变情况分析

近些年来，我国学者对中国地方品种牛的MSTN基因突变情况做了一些研究。由于长期以来我国地方品种牛主要用于役用而非肉用，历史上没有形成典型的肉用牛品种。近年来，随着国家对地方品种肉牛培育和改良的支持，逐渐引进了国外肉牛的突变型MSTN基因，形成了具有地方特色的优秀肉牛品系。

3.1 秦川牛、南阳牛和渤海黑牛MSTN基因多态性

史明艳等[19,20]采用PCR-SSCP法对秦川牛与南阳牛进行检测，发现南阳牛中存在双肌个体，随后又对秦川牛和南阳牛的MSTN基因第三外显子进行了多态性分析，在45头南阳牛中发现1头牛的nt938 bp处发生G→A单核苷酸突变，但在秦川牛中没有发现突变现象。在这1例发生突变的南阳牛中，其突变位点与皮尔蒙特牛的自然突变位点一致，推测该例南阳牛可能含有皮尔蒙特牛的血统。在对渤海黑牛的研究中，2009年，刘桂芬等[21]发现MSTN基因第一外显子的nt111 bp处存在一个突变，在第二和第三外显子中没有发现突变。然而，该结果与刘桂芬等在2011年的报道相矛盾，在578头渤海黑牛的MSTN基因第一和第二外显子中均未发现多态位点；在第三外显子中发现两个多态性位点，即nt330 bp处存在1个G→A转换、nt336 bp处存在1个C→T转换[22]。在所研究的渤海黑牛群体中，并没有发现明显的双肌性状个体，而且MSTN基因的突变个体在体尺性状上并没有优势。因而，在秦川牛和渤海黑牛中是否存在MSTN有义突变，尚需进一步证实。

3.2 草原红牛和皖东/南牛MSTN基因多态性

郭丹等[23]对草原红牛和利草杂交牛(利木赞与草原红牛杂交)MSTN基因进行单核苷酸多态性分析，发现草原红牛在第一外显子的nt282 bp处发生了C→A的碱基突变，该突变导致编码的氨基酸由苯丙氨酸变为亮氨酸。由于该突变位点与利木赞牛MSTN基因第一外显子的突变位点一致[18]，推测发生在草原红牛的该位点突变应来自利木赞牛。拥有该突变的利草杂交牛的日增重、屠宰率、净肉率和肉骨比等均显著高于普通草原红牛[23]。另外，张胜等[24]对40头草原红牛的MSTN基因第一内含子进行多态性分析，发现在nt1452 bp处存在C→T突变，该位点突变对草原红牛的净肉率有显著影响(P<0.05)。

刘洪瑜等[25]分析了皖东牛、皖南牛、和牛和西门塔尔牛4个群体的MSTN基因的第一外显子多态性，发现MSTN基因第一外显子1的nt267 bp发生A→G的同义突变，在所检测牛群中存在3种基因型(AA、GG、AG)，A等位基因为优势基因。该位点在4个牛群体中均处于中度多态。

3.3 云岭牛和辽育白牛MSTN基因多态性

云岭牛是我国第一个三元杂交培育的肉用品种，和占星等[26]对该牛MSTN基因第二外显子进行多态性分析，发现在nt39 bp、nt46 bp、nt84 bp与nt266 bp等位点存在多态性，前3个位点均为同义突变，第266位点为错义突变。王娇娇等[27]在辽育白牛MSTN基因5′调控区发现了4个突变位点，分别是nt805 bp位点的G→C突变、nt163 bp处的T缺失突变、nt156 bp位点的A插入突变和nt130 bp位点的A插入突变；在编码区nt571 bp处发生A→G突变，3′-UTR nt5387 bp处发生C→T突变。辽育白牛是由夏洛莱牛与本地黄牛杂交选育而成，其中夏洛莱牛遗传成分占比高达93.75%[28]，推测辽育白牛的MSTN突变及其突变类型来自夏洛莱牛。利用双肌皮尔蒙特牛与荷斯坦奶牛杂交，在皮荷杂种牛中发现了来自皮尔蒙特牛的MSTN突变位点，所有杂交牛均为杂合突变[29]。

3.4 牦牛MSTN基因多态性

在牦牛中也存在MSTN基因的自然突变。梁春年等[30]对牦牛MSTN基因第二内含子分析发现，在其扩增片段的nt192 bp处存在A→G突变。此变异对成年牦牛胸围、体质量、胸围指数、体长指数和肉用指数等均有显著影响(P<0.05)。刘应祥等[31]对牦牛MSTN基因的遗传变异做了分析，发现了4个多态位点，有2处位于第二外显子，2处位于第一内含子。张丽等[32]对天祝白牦牛和甘南牦牛MSTN基因序列比对发现，两个牦牛亚种间相差不大，仅在第二外显子nt417 bp处存在C→T突变，属同义突变。

以分别代表普通牛、瘤牛、牦牛和大额牛的蒙古牛、雷琼牛、巴州牦牛与独龙牛为对象，常春芳等[33]对这几种牛的MSTN基因第二外显子进行了多态性分析。在4个牛品种66个样本中，第二外显子出现了3个SNPs位点，即nt414 bp(C→T)、nt639 bp(A→G)和nt704 bp(A→G)。其中，nt414 bp和nt639 bp位点属于同义突变，nt704 bp位点变异为非同义突变，编码氨基酸由组氨酸突变为精氨酸。在对中国瘤牛、普通牛、牦牛和大额牛4个牛属MSTN基因外显子区核苷酸序列对比研究中，发现了7个SNPs位点，只有1个位点是有义突变，由(aa235)组氨酸突变为精氨酸[34]。由于组氨酸与精氨酸均属碱性氨基酸，并且具有相似的功能基团，对蛋白质功能影响不大。

由上可知，虽然在某些品种牛中发现了MSTN有义突变，但由于无法证实所使用的牛群样本没有受到引进品种如利木赞牛、夏洛莱牛、皮尔蒙特牛的杂交行为，因而推测，中国本土牛存在可形成双肌表型的MSTN基因自然突变的可能性不大(图4，彩图见图版一)。

图4 中国黄牛MSTN基因突变位点示意图Fig.4 The diagram of the mutation in Chinese cattle MSTN gene.注：红色代表有义突变，蓝色代表无义突变。(彩图见图版一)

4 牛MSTN基因突变引起的遗传效应

MSTN基因突变引起了肌肉发育的变化，肌纤维数量和体积增大，增加了肌肉中糖分解型肌纤维的比例，改变了肌肉的代谢活动。但是MSTN基因的效应不仅仅体现在肌肉方面，个体的体重、各器官重等均发生了显著变化。

4.1 MSTN基因突变对骨骼肌发育的影响

牛MSTN基因突变引起的双肌现象，使产肉量显著提高。所谓“双肌”，并不是出现了双倍的肌肉，而主要是由于肌纤维数量的增多(hyperplasia)和一定程度的肌纤维增大(hypertrophy)所致，动物在表观上呈现肌肉发达、块肌显著。在MSTN突变个体中，肌纤维总数[35～37]和糖分解型快肌纤维(fast glycolytic fibers)的比例[37,38]显著提高，这是由于解除了MSTN对成肌细胞增殖和分化的抑制作用所致。

MSTN突变的双肌牛的总体肌肉量提高，而且躯体不同位置的肌肉情况有差别。躯体前半部分的变化范围为8%～51%，后半部分为9%～34%[8]。而且伴有糖分解型快肌纤维增多、糖原含量减少，肌红蛋白、脂肪、胶原蛋白、线粒体数量和毛细血管密度等均减少[39]。在肌纤维肥大的同时，骨骼质量发生了变化。相对提高的肌肉重量意味着突变牛骨肉比低于非突变牛的骨肉比，骨重量变化了2.9%～9.6%。肌纤维肥大与相对的骨重量减轻，其结果是胴体质量的提高，屠宰率和净肉率提高[40]。

4.2 MSTN基因突变对出生重和成体内脏器官的影响

突变比利时蓝牛的初产牛的出生重与成牛体重的比率为9.0%，经产牛的犊牛出生重占比为8.3%；荷斯坦奶牛初产牛和经产牛的犊牛出生重与成牛体重的占比分别为7.5%和6.5%。因而，在大多数情况下，突变型比利时蓝牛的生产需要剖腹。剖腹的副作用是延迟了繁殖周期，剖腹产牛的世代间隔为435 d，而自然产牛为393 d[41]。

某些双肌型牛成体内脏器官重量相对减轻。在一些双肌型比利时蓝牛中，以器官重占总体重的比率为指标，消化系统减少了18%、肝脏减少了16%、心脏减少了14%、肺脏减少19%、脾脏减少37%、肾上腺减少了10%[8,42]。肺脏重量的减少，对突变动物呼吸功能造成了负面影响[43]。在突变牛中易发生呼吸管道水肿，可能是类胆碱的支气管收缩与β-肾上腺支气管扩张对自主神经系统的综合作用所致，这可能就是突变牛易感呼吸系统疾病的原因[43]。与荷斯坦牛相比，Clinquart等[44]发现突变比利时蓝牛的干物质消化能力显著下降(-4.6%,P<0.01)，消化能力也显著下降(-2.7%)；但也有报道认为突变蓝牛的干物质消化能力要高于(1.1%)非突变的比利时蓝牛[45]。

综上所述，MSTN基因突变在促进肌肉生长的同时，也引起了内脏器官减轻和免疫器官减小，突变牛的呼吸与免疫等方面的发病率升高。这些异常表现主要集中在纯合突变的比利时蓝牛群体中，在其他品种MSTN突变牛群体中的表现并不显著。

5 MSTN基因突变牛的杂交应用

MSTN基因纯合突变牛(比利时蓝牛)存在耐力较差、呼吸与免疫疾病发病率高与难产率高等问题，但作为父本与其他品种牛杂交生产F1代商品牛则具有极显著的经济意义，产肉性能显著提高，肉品质也得到改善。

5.1 杂交牛的产肉性能显著提高

与非突变牛相比，MSTN突变牛的生长速度与肌肉产量显著提高，牛肉的脂肪含量显著下降，瘦肉率显著高于普通牛。以同样600 kg重的双肌比利时蓝牛与普通牛相比，屠宰率分别为70%和64%，冷胴体重量分别为420 kg和384 kg，屠宰率和净肉率显著提高[46]。Casas等[47,48]对536头比利时蓝牛杂合后代牛进行生产性能分析，屠宰重显著高于普通牛(P<0.05)、后腿与后臀重显著高于普通牛(P<0.001)；里脊肉显著增重(P<0.001)、眼肌面积显著增大(P<0.05)。这些结果说明，比利时蓝牛的杂合子后代的产肉量与肉质品质显著好于普通肉牛。Short等[49]对皮尔蒙特、利木赞和海福特3种公牛的F2代的生长、育肥和屠宰进行研究表明，双肌型皮尔蒙特牛的后代的初生重显著高于海福特牛后代，产肉性能显著提高，脂肪含量明显降低；利木赞牛的后代出生体重小于皮尔蒙特牛后代，高于海福特牛后代，断奶重高，生长快速，肌肉多、脂肪少，骨盆大，饲料转化率高。Sellick等[50]发现拥有F94L突变位点的利木赞牛及其杂交后代的肌肉生长能力显著增强，与对照相比，腿肌增加了5.5%，眼肌面积增加了2.3%。

5.2 杂交牛的肉品质显著提高

基因型与等位基因数目对于肌肉等级、脂肪厚度、生产难易度有显著影响。无论是比利时蓝牛突变型，还是皮尔蒙特牛突变型，杂合后代牛的表型都是瘦肉率高，胴体重高。因而，在生产型配种时，可以最大限度的获得杂合型牛，以提高胴体产出。Wheeler等[51]对皮尔蒙特双肌牛后代的背最长肌(longissimus thoracis，LD)、臀中肌(gluteus medius，GM)、半膜肌(semimembranosus，SM)和股二头肌(biceps femoris，BF)4种肌肉组织的嫩度进行比较分析。结果表明，在4种肌组织中，杂合突变与纯合突变型牛肉的嫩度、易碎性和结缔组织量显著高于野生型。纯合突变型的所有肌肉类型的多汁性要低于杂合型和野生型；纯合型几种肌肉的风味要低于杂合与野生型。野生型、杂合型和纯合型不同部位肉的嫩度排序分别为LD>GM>SM>BF、LD>GM>SM>BF、LD>GM>BF>SM。Wiener等[52]研究了双肌比利时蓝公牛与南德温牛(south devon)杂交后代的生长、体况和产肉性能。杂合突变牛的产肉率显著提高，减少了脂肪厚度，也提高了肌肉等级。

Allais等[53]研究了法国的2种MSTN基因中具有Q204X和nt821突变的夏洛莱牛、利木赞牛和阿奎坦牛，发现带有Q204X突变的公牛胴体的脂肪含量、肌间脂肪含量和胶原成分比普通牛显著减少；而嫩度比普通牛提高，他们还利用芯片技术分别分析了3种公牛及其后代公牛的肌内脂肪含量、肉质光度、剪切力和嫩度等肉质性状，显示剪切力和嫩度指数高度遗传相关，夏洛莱牛和利木赞牛是-0.91，阿奎坦牛是-0.86，3个品种之间并无统计学差异。Ramayo-Caldas等[54]利用系统生物学方法分析夏洛莱牛、利木赞牛和阿奎坦牛的嫩度及其他肉质性状相关基因的互作关系，共检测到206个与剪切力相关的共同基因，这些基因中的SNPs可以解释28%～30%之间的不同品种剪切力的表型差异。

6 展望

我国牛种资源丰富，地方品种约有53个，是世界上牛品种最多的国家。历史上，我国的黄牛品种如鲁西牛、秦川牛、南阳牛、延边牛、晋南牛等均经过服从耕田拉车的役用选择，以速度和耐力为选育标准，所形成的黄牛基本为前驱壮硕，臀部流线型，躯干与四肢肌肉结实但欠发达。与安格斯、西门塔尔、海福特、利木赞、夏洛莱等国外优良肉牛品种相比，国内黄牛品种的产肉性能与生产性能劣势显著，养殖效益远不如国外品种。

前已述及，在我国黄牛个别品种中也检测到了MSTN基因突变的现象，但现有研究数据仍无法确证这些突变会产生肌肉发达的双肌表型。为了快速提高本土牛的生长与产肉性能，国内的科研人员也进行了一些尝试。Luo等[55]利用锌指核酸酶技术对鲁西牛的MSTN基因进行编辑，筛选出基因缺失突变的成纤维细胞，再制备转基因克隆胚胎，经过胚胎移植后，获得了MSTN基因编辑牛。所获得的基因编辑牛呈现与自然双肌牛类似的肌肉表型。本实验室以鲁西黄牛和蒙古牛为对象，利用CRISPR/Cas9对其MSTN基因进行定点编辑，初步培育出表型良好的MSTN编辑基因牛。利用基因编辑公牛的精液与鲁西牛、安格斯牛、蒙古牛和西门塔尔牛进行杂交，所生产的F1代牛均表现出肌肉发达的表型(未发表数据)。另外，我国学者对猪的MSTN基因进行编辑，获得了表型突出的基因编辑猪，其产肉量和瘦肉率显著高于对照组猪[56～58]。上述试验结果表明，利用MSTN基因，可以改变牛和猪的体型体况，提高其生长发育和产肉量，可以培育出肉用家畜育种新材料或新品种[59]。

随着对MSTN基因突变引起一系列生理效应机制的研究，研究者们进一步了解了MSTN基因突变与表型之间的关联关系，可以设想通过位点选择、调控因子介入与条件性编辑等技术，对我国本土牛的MSTN基因实施编辑改造，从而使MSTN基因突变效应发挥到适当水平，使所培育的基因编辑牛的生长速度与产肉率适中，同时不会引起器官变化、免疫变化以及难产率升高等问题。

参 考 文 献

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