CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的研究进展

吕宝北, 赵鹏翔, 张 鑫, 马雪梅, 谢 飞

北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124

癌症作为威胁人类健康及生命的一种严重疾病，其发生率和死亡率一直居高不下。其病因往往是细胞基因组中的突变或遗传缺陷不断积累后，最终导致细胞永生化。通过多种独立的系统性基因分析技术对肿瘤基因组研究后发现，一种肿瘤细胞中的突变或遗传缺陷往往具有特定的特征[1]，因此通过修复肿瘤细胞基因组或者沉默其中特定蛋白的表达成为研究和治疗肿瘤的重要手段[2]。自从CRISPR/Cas9首次被应用于基因编辑后，已经有很多学者尝试将其应用于肿瘤病因和治疗的研究中。由于CRISPR/Cas9具有操作简单、特异性强、效率高等优势，可以利用其对细胞的基因组进行编辑，从而探究肿瘤发生、发展和转移的机理。另外还可以对引发肿瘤的基因突变进行修复，或对特定蛋白分子进行敲除，从而实现肿瘤的治疗。随着CRISPR/Cas9技术的进步，其在肿瘤研究中的应用也越来越广泛。本文将对CRISPR/Cas9在肿瘤研究中的应用进行综述，以期为肿瘤的发生、转移和治疗等相关研究提供参考。

1 CRISPR/Cas9在肿瘤产生机制研究中的应用

作为一种强大的基因编辑工具，CRISPR/Cas9最擅长的应用领域是特定蛋白功能的研究。通过设计相应sgRNA将目的基因进行敲除后研究突变型与野生型的基因差异以及对细胞和生物体的影响，从而确认其生物学功能。强大的基因编辑功能可以帮助科学家更加深入的理解基因与表型之间的因果关系，为肿瘤发生机制的研究提供更广阔的前景[3]。

1.1 肿瘤干细胞中单核苷酸突变形成机制的研究

肿瘤干细胞与正常干细胞具有相似的特征，在肿瘤早期的形成、转移及抗药性方面具有重要作用[4]。目前关于肿瘤干细胞的形成主要有两个推测，即其有可能是从其他正常干细胞突变而来，或者由细胞去分化后形成。CD44表面抗原糖蛋白通常作为肿瘤干细胞的标志物之一，CD44阳性细胞往往具有更强的转移性。利用CRISPR/Cas9将CD44基因敲除后，肿瘤干细胞在小鼠肝脏中的恶性程度和分化程度大大降低[5]。此外，将干细胞中的重要错配修复基因MLH1敲除后，细胞极易癌变成为永生细胞，这也在一定程度上证明了基因突变在肿瘤干细胞形成中的作用[6]。Matono等[7]通过CRISPR/Cas9将直肠肿瘤中常见的WNT、MAPK、TGF-β等信号通路中的突变引入到人体正常肠上皮细胞中，通过调节培养条件后模拟肠上皮细胞的生态环境，随后选择了具有多个抑癌基因和癌基因突变的细胞，并将其导入小鼠脾脏，结果发现肿瘤可以形成，但是并未发生转移，因此肿瘤发生和转移所涉及的基因可能并不一致。

1.2 染色体异位对肿瘤发生的机制研究

肿瘤相关的染色体异位发生在肿瘤形成过程中的DNA双链断裂后，由非同源的DNA结合导致，这也是肿瘤形成的重要机制之一[8]。因此获得可以模拟染色体异位的细胞模型在肿瘤发生机制的研究中至关重要，而目前对于相应细胞和动物模型的缺乏也限制了对肿瘤发生机制和治疗手段的研究。

通过在相应位点设计sgRNA，可以利用CRISPR/Cas9引发HEK293A细胞以及间叶细胞和骨髓细胞中产生双链断裂，从而模拟肿瘤的形成过程，避免了直接培养的肿瘤细胞在传代过程中产生新的突变从而影响实验结果。另外，建立的细胞模型也可用于抗肿瘤药物的筛选[9]。如果在sgRNA引发双链断裂后，引入一个DNA模板使得DNA通过同源修复重新连接在一起，则可以提高模型建立的效率[10]，其精确度也大大提高[11]。Spraggon等[12]通过CRISRP/Cas9与DNA双链断裂的同源性修复结合，在人体细胞系中表达染色体异位的产物，建立了尤因氏肉瘤和促纤维增生小细胞叶瘤的细胞模型，并可以实现对细胞内染色体异位的表达量控制，为融合基因导致的肿瘤研究提供了新的手段。另外，Jiang等[13]利用CRISPR/Cas9构建了小鼠胚胎干细胞染色体异位细胞系，并且通过将细胞系注射入宿主胚胎中建立了嵌合体小鼠模型。

1.3 CRISPR/Cas9在肿瘤细胞缺陷基因筛选中的应用

系统性的基因缺陷筛选是肿瘤研究中的重要手段，可以帮助研究者理解肿瘤形成和肿瘤细胞对抗癌药物产生抗性的原因。此前主要的手段是RNA干扰，但是由于其对基因的抑制效率并不高，并且有脱靶效应，因此会导致假阳性和假阴性结果[14]。如果设计引物获得sgRNA文库，并将其导入细胞中，就可以在sgRNA的引导下对基因组进行大规模的敲除，从而筛选对硫鸟嘌呤(抗癌药)的抗性基因突变，与预期结果一致[15]。为了解决PD-1检查点阻滞免疫疗法在一些肿瘤患者中失效的问题，Manguso等[16]通过CRISPR/Cas9编辑在免疫疗法处理的小鼠肿瘤组织中发现，干扰素-γ信号通路中的缺陷导致了对免疫疗法的抗性。将CRISPR/Cas9技术与数字技术相结合，可以用计算机设计数以千万计的sgRNA，采用慢病毒或逆转录病毒把每个sgRNA分别导入单个哺乳动物细胞，实现对哺乳动物基因功能的高通量扫描。使用CRISPR/Cas9在增强子元件内进行功能扫描研究，发现p53效应基因CDKN1A的p53结合增强子是永生化人体细胞中致癌基因诱导的衰老所必需的元件[17]。

1.4 CRISPR/Cas9在肿瘤动物模型构建中的应用

由于肿瘤细胞基因组的复杂性，在每个肿瘤细胞中往往含有多达几百个点突变、染色体的异位和缺失等，因此构建相应的动物模型对于肿瘤产生机制的研究至关重要。在小鼠受精卵中同时注入Cas9蛋白的mRNA及多个不同的sgRNA后，可以对Sox2、Oct4和Mecp2等重要的肿瘤干细胞基因进行编辑，构建在相应基因带有标签或荧光基团的小鼠模型[18]。同时，CRISPR/Cas9也被应用于建立Tet1和Tet2基因同时产生突变的动物模型，采用的方式同样是在受精卵细胞中同时注入Cas9蛋白的mRNA和sgRNA[19]。此外，通过体细胞构建动物模型是研究非家族性肿瘤发生原因的重要手段，但是其面对的主要难题就是将Cas9基因运输至目的细胞内。利用流体动力学注射法将Cas9和sgRNA导入大鼠肝脏细胞后，对两个抑癌基因Pten和p53进行沉默即可引发肿瘤形成[20]。以上研究表明CRISPR/Cas9是一种快速、简便、可靠的构建肿瘤动物模型的手段，为学者研究肿瘤基因型与表现型之间的关系提供了合适的实验材料。

2 CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的应用

将CRISPR/Cas9应用于肿瘤治疗的理论基础是肿瘤细胞的致癌基因依赖性，即肿瘤细胞中单个基因的失活即有可能导致其生长停止[21]。关于其机理目前尚无定论，已有的假说包括遗传优化、致癌基因失忆等[22]。尽管如此，这也为肿瘤的治疗提供了新的思路。其中，由于病毒引起的肿瘤机制比较明确，即可将病毒基因作为基因编辑的靶点，因此该类肿瘤也成为CRISPR/Cas9应用的主要目标。自从第一例利用基因编辑技术对肿瘤进行体外治疗在中国出现后，关于其研究的文献便呈指数态势发展[23]。

2.1 EBV诱发的淋巴癌和鼻咽癌治疗

EBV病毒(epstein-barr virus)是一种双链DNA病毒，在淋巴癌和鼻咽癌的发病中发挥重要作用。在复制的早期，EBV可以感染淋巴癌和鼻咽癌细胞，随后EBV会表达几种蛋白导致细胞的癌变，包括EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1, EBNA-1)、EBNA-2和晚期膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP-1)和LMP-2。将EBNA和LMP蛋白作为靶点，用CRISPR/Cas9敲除后可以显著降低肿瘤细胞活性，减少肿瘤细胞的增殖[24]。

2014年，CRIPSR/Cas9开始应用于基因编辑，Yuen等[25]在多个人体细胞系中进行了EBV病毒的基因编辑。通过以BART(BamHI A rightward transcript)的启动子为靶位点设计sgRNA，一段558bp的基因片段被敲除，能够显著降低EBV对健康细胞的感染能力。在最新的研究中，针对EBV不同靶位点设计的sgRNA转染进入C666-1细胞系后，EBV的含量降低了约50%，并且可以持续数周。但是再次转染并不能将病毒载量进一步降低。虽然CRISPR/Cas9无法将EBV完全从细胞中清除，但是可以大大增加EBV感染细胞对抗肿瘤药物的敏感性，也是一种潜在的鼻咽癌治疗手段[26]。

2.2 HPV诱发的宫颈癌治疗

在2012年癌症引发的女性死亡病例中，宫颈癌排名第四[27]，并且病例的5年生存率已经20多年并未发生变化，其治疗手段目前已处于瓶颈期[28]。宫颈癌由人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，其细胞生长依赖于HPV E6和E7蛋白的表达，因此对这两个基因的抑制和敲除是宫颈癌治疗中的一个重要研究方向。E6基因抑制会激活细胞的P53途径，导致癌细胞的衰老和凋亡。而E7基因与成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的重建相关，抑制其活性可以引起癌细胞衰老。在以往的研究中，通过RNA干扰抑制两个基因的表达，可使得肿瘤生长停止[29]。

随着CIRSPR/Cas9技术的迅速发展，其也被应用于宫颈癌的治疗。在HPV-16和HPV-18细胞系中，通过敲除E6和E7两个基因，细胞的p53和pRb基因水平恢复正常，从而导致肿瘤细胞的程序性死亡[30]。在裸鼠实验中，通过对两个基因敲除后，其肿瘤生长也完全停止[31]。除此之外，通过敲除E6基因的上游早期启动子区域p97，也可以将两个基因的表达抑制，因此针对两个基因的调控序列进行敲除也是治疗手段之一。例如可以通过敲除位于E4基因上游的启动子或者E5的一个启动子调节L1衣壳蛋白的表达，从而使得细胞程序性死亡。

2.3 CRISPR/Cas9在其他肿瘤治疗中的应用

由于肿瘤发生的原因和肿瘤微环境在不断发生变化，因此在肿瘤治疗中设计一个有效的治疗手段需要面对诸多困难。而在发病原因相对确定的病毒诱发肿瘤中，如果需要编辑病毒基因组以减少病毒载量，则CRIPSR/Cas9就是一个理想的技术手段。

在非小细胞肺癌中，程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)会抑制免疫反应，因此可以将病人的T细胞PD-1蛋白提取后进行基因编辑，随后筛选敲除成功的细胞，重新注射回机体，触发人体免疫反应以清除肿瘤细胞[32]。目前首例将CRISPR/Cas9应用于人体实验以敲除PD-1基因的研究仍在进行。

嵌合抗原受体T细胞和细胞周期检查点抑制剂是肿瘤治疗研究中的新兴手段，如果将二者结合，可能会具有更大的临床应用价值。Levi等[33]发现程序性死亡配体1(PD-L1)的表达会抑制嵌合抗原受体T细胞的肿瘤清除效应，因此将sgRNA通过慢病毒转导融合进入细胞基因组，从而获得PD-L1缺陷细胞，其对胰腺癌细胞的清除能力获得提高。

2.4 CRISPR/Cas9在肿瘤治疗靶点筛选中的应用

在CRISPR/Cas9之前已经有学者用RNA干扰或第二代基因编辑技术进行新的肿瘤基因筛选[34]。而CRISPR/Cas9的出现则提供了新的快速筛选未知肿瘤治疗靶点的手段。在肝癌研究中，向人工诱发的肿瘤细胞中转入sgRNA文库，随后将该细胞注射入裸鼠，将单克隆细胞形成的肿瘤进行基因序列分析，鉴定出NF1、TSC2、NF2、BIM和Plnb1 5个与肿瘤生长密切相关的基因[35]。Manguso等[36]通过sgRNA文库筛选了黑色素瘤细胞中的2 400个基因，证明Ptpn2的缺失可以引发细胞的免疫反应，从而使其作为治疗时的靶基因[16]。CRISPR/Cas9将有助于肿瘤细胞中新致癌基因的发现及验证其在肿瘤发生和转移中的关键作用，从而为肿瘤的治疗提供新的靶点。

3 CRISPR/Cas9应用于肿瘤研究的难点和挑战

尽管CRISPR/Cas9在肿瘤研究中已经有多方面应用，但是目前仍面临多个挑战需要解决，包括Cas9基因运输、脱靶效应及安全性问题等。

3.1 Cas9基因的运输

将CRISPR/Cas9应用于肿瘤动物模型构建和肿瘤治疗时，最大的挑战就是如何提高将CRISPR/Cas9复合体输送至目的基因的效率。在动物模型的构建中，选用合适的输送方式将Cas9基因运送至目的基因，提高其输送效率，对于成功建立动物模型十分关键。另外，通过寻找Cas9蛋白的同源蛋白，也可以提高其包装和输送的成功率[37]。在肿瘤的治疗中，目前主要有腺病毒、慢病毒和非病毒的物理方式。由于腺病毒的免疫原性导致其在临床应用中受到限制[38]。慢病毒由于其可以将自身基因组整合至宿主基因组的特性，可以实现相应致癌基因的永久敲除。但是若sgRNA与宿主细胞基因组完全整合，sgRNA也无法发挥其引导作用，因此某些整合酶缺陷的慢病毒突变体更加适合肿瘤治疗应用[39]。另外一种方式则是将Cas9分为两部分后，分别导入宿主细胞中，随后sgRNA可以与二者重组成为复合体，发挥其剪切作用[40]。

3.2 脱靶效应

潜在的脱靶效应也是CRISPR/Cas9在肿瘤研究应用中面临的挑战。在细胞实验中，如果Cas9蛋白无法定位至目的基因，极易造成实验结果的假阳性或假阴性。而在构建动物模型时需要极低的脱靶效应才能提高成功率，例如使用Cas9D10A内切酶和补偿sgRNA[41]，或者缩短的sgRNA等手段[42]，可以明显降低其脱靶效应。在肿瘤的临床治疗中，即使是极低的脱靶效应也是非常危险的，其会导致小片段的插入/缺失突变或者大规模的基因组改变[43]。目前也有多种手段降低其脱靶效应，例如设计的sgRNA与基因组中目的基因序列高度同源，从而避免其错配效应[44]，或者通过应用Cas9蛋白的突变体，提高其与靶标结合的效率等[45]。

3.3 CRISPR/Cas9的安全性和成本等问题

尽管CRISPR/Cas9是一种简便高效的基因编辑工具，但是其安全性在科学界并未达成共识[46]。其安全性应当通过在细胞和动物实验中的大规模统计来进行验证[47]。此外，CRISPR/Cas9的实际应用还需要解决成本问题。例如，由于每个病人体内发生突变的碱基可能具有特异性，尤其是特别稀有的突变，需要给每个病人设计独特的sgRNA，导致其成本会特别昂贵[48]。其次就是针对每一种肿瘤需要建立其相应的治疗阈值，即需要多少基因组的编辑才可能实现对肿瘤的治疗，而这又取决于设计sgRNA的结合效率、在体内的运输效率和靶细胞的适应程度等多种因素[49]。

4 展望

在过去的几年内， CRISPR/Cas9作为一种稳定、高效且广泛应用的基因编辑技术出现，发展非常迅速。通过将目的基因精确的沉默或激活，可以研究相应基因在生物体内的功能[50]。在肿瘤产生机制的研究中，通过CRISPR/Cas9将相应预期基因敲除后，即可研究相应基因在肿瘤发生和发展中的作用。在肿瘤的缺陷基因筛选和治疗中，CRISPR/Cas9也有相应研究。目前针对病毒引发的肿瘤已经有研究将其基因组编辑后抑制肿瘤细胞生长。尽管面临Cas9蛋白运输效率低、一定的脱靶效应以及成本高等缺陷，CRISPR/Cas9在肿瘤研究和治疗中仍然具有巨大的应用潜力。

参 考 文 献

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