新疆部分地区致犊牛腹泻轮状病毒病的调查*

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原之一，感染轮状病毒的犊牛表现为消瘦、脱水、排蛋花状水样粪便，病情严重者常并发或继发其他病毒、细菌、寄生虫等感染[1]，导致规模化牛场犊牛死亡率升高[2]，目前轮状病毒的检测方法主要是病毒的分离鉴定[3-4]、RT-PCR[5-6]、半巢氏 RT-CR[7]、ELISA[8]等。张坤[9]等通过RT-PCR等方法对新疆北疆地区致犊牛腹泻轮状病毒病的调查发现，规模化牛场中犊牛存在感染。轮状病毒结构蛋白中VP6蛋白构成轮状病毒内衣壳[10]，具有良好的免疫原性和抗原性[11]。本研究利用VP6设计引物，运用RT-PCR和ELISA方法对新疆规模化牛场致犊牛腹泻病原轮状病毒病进行调查研究，以便为犊牛腹泻采取防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂与仪器

ELISA双抗体夹心检测试剂盒购自上海润裕生物技术有限公司，pMD19-T克隆载体、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自宝生物工程大连公司（Takara），RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司，2×Taq PCR MAsterMix溶液、DH5a菌株制备的感受态细胞均购自北京天根生物科技有限公司。试验仪器主要有酶标仪、微量震荡仪器和离心机（Costar公司）。

1.1.2 样本采集

采集石河子地区奶牛场、石河子地区某肉牛场、昌吉奶牛场、奎屯地区奶牛场等地区腹泻犊牛粪便共172份，于-80℃冰箱保存待检。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

将腹泻犊牛粪便样品与等体积的PBS于冰上充分研磨，进行超声破碎，反复冻融，最后12 000 r离心30 min，取上清液用于PCR模板检测和牛轮状病毒ELISA试剂盒检测。

1.2.2 牛轮状病毒VP6基因的引物设计

根据GenBank公布的BRV基因序列VP6设计引物（见表1）。

1.2.3 总RNA的提取

按照说明书Trizol法，处理后的样品加入适量的Trizol后，用无RNA酶枪头反复吹打混匀，使样品充分裂解，分离蛋白核酸复合物，静置10 min后加入1/5 Trizol量的氯仿，震荡混匀后静置5 min，在预冷的4℃离心机中12 000 r离心15 min，EP管中的液体分为3层，提取的RNA主要在上层的无色液体中，利用特制的带收集管的吸附柱，将无色液体和等量的无水乙醇全部加入吸附柱中，进行离心，用无RNA酶水进行洗脱收集得到的RNA，提取RNA后，进行反转录，具体反应体系如表2。

表1 牛轮状病毒VP6基因PCR扩增引物信息

表2 反转录反应体系

1.2.4 PCR反应

PCR 反应体系 （20 μL）：2 × Es Taq Master mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反应条件：95℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 个循环后，72℃延伸10 min。扩增反应结束后，将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，同时琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳和目的条带回收

称取琼脂糖1.2 g、1×TBE电泳缓冲液60 mL，配置成2%的琼脂糖凝胶溶液，经微波炉加热，完全溶解，室温静置，滴加EB染液后充分混匀，将其倒入制胶槽中，约30 min后凝固，20 uL点样，180 V、120 mA进行电泳，结束后将胶放入凝胶成像仪器中，进行拍照保存。

目的条带的回收：用切胶刀将目的条带在紫外灯下切除，置于无RNA酶的EP中加入适量的溶胶液，进行50℃水浴溶解，充分溶解后加入特制的吸附柱中，离心后，加入无水乙醇进行洗脱，最后用无RNA酶水进行洗脱，收集得到的洗脱液。

1.2.6 目的基因的连接（表3）

表3 目的基因的连接反应体系

1.2.7 转化及菌液PCR鉴定

转化按照说明书进行操作，采用经特殊工艺制作的DH5α感受态细胞进行DNA的热激转化，将连接产物加入置于冰上缓慢融化的DH5α感受态细胞中，用移液器吹打混匀后，置于冰上30 min，进行42℃水浴热激90 s后迅速置于冰上，加入适量的LB液体后，37℃、170 r摇床上摇4 h，离心取沉淀涂于固体LB平板上。

菌液PCR的鉴定及测序：从转化平皿中挑取单菌落加入氨苄抗性的LB液体培养基，37℃、180 r摇床培养4 h，进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌，扩大培养后提取质粒送上海生工测序。

1.2.8 牛轮状病毒抗原ELISA检测

按照牛轮状病毒抗原ELISA说明书进行。试剂盒原理是双抗体夹心法，将处理好的样品上清液吸取200 μL加入已经预先包被牛轮状病毒捕获抗体的微孔中，同时设置阴、阳性对照孔和空白孔，除空白孔外，样品孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，微量震荡仪器上震荡混匀，用封板膜封好后置于37℃恒温培养箱中作用1 h，取出弃掉微孔中的液体，每孔用洗涤液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用终止液进行终止，在450 nm的酶标仪上进行读数。

2 结果与分析

2.1 PCR检测的牛轮状病毒感染情况

表4 新疆部分地区规模化牛场牛轮状病毒检测结果

经PCR方法对新疆部分地区规模化牛场172份腹泻犊牛粪便样品进行检测，检出阳性份数127份，阳性率73.83%（表4）。犊牛粪便中VP6基因检测的结果（图1、图2）运用DNAMAN软件将牛轮状病毒VP6基因测序结果与标准序列进行在线比对，发现两者同源性达到100%（部分图）。

图1 某规模化牛场腹泻犊牛粪便轮状病毒VP6基因检测结果

2.2 ELISA检测结果

表5 ELISA方法检测结果

经ELISA方法对新疆部分地区规模化牛场172份腹泻犊牛粪便样品进行检测，阳性份数100份，阳性率 72%（表5）。

图2 牛轮状病毒VP6基因与标准序列比对结果

3 讨论

牛轮状病毒VP6基因，是诊断牛轮状病毒感染的常用基因，本研究通过设计牛轮状病毒VP6基因引物，通过测序，将测序结果分别与牛轮状病毒VP6基因标准序列通过DNAMAN软件进行在线比对，发现扩增出的牛轮状病毒VP6基因与标准序列的同源性为100%，可以判定被调查牛场犊牛遭受轮状病毒病感染。

ELISA方法是进行大量样本检测的首选，本调查经ELISA方法对新疆部分地区规模化牛场腹泻犊牛粪便样品进行检测，阳性率72%（100/172），经RT-PCR方法检测犊牛粪便样品，阳性率73.83%（127/172），这比张坤[9，12]等应用 RT-PCR 和 ELISA方法检测报道的调查结果略高。综合PCR和ELISA方法各自的优点，可对腹泻犊牛的轮状病毒感染提供较为准确的诊断。

参考文献

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[12]张坤.新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究[D].石河子：石河子大学，2016.