L-NMMA对阿尔茨海默病模型大鼠海马齿状回区谷氨酸含量的影响

王玮瑶 占素扬 孙传博 赵 可 金清华

(延边大学医学院生理学与病理生理学教研室，吉林 延吉 133002)

阿尔茨海默病(AD)患者海马会出现以齿状回区(DG)体积明显缩小、神经元密度明显降低、树突长度明显变短为主要特征的病理学改变；在AD模型鼠中，海马DG也会出现类似的如神经元突触后致密带厚度变薄、突触间隙增宽、突触界面曲率降低等形态学改变〔1〕。L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)属于氨基酸类非选择性一氧化氮(NO)合成酶(NOS)抑制剂，可以有效抑制NOS活性，对NO的生成有较强且全面的抑制作用。NO是细胞与细胞之间信息传递的重要的调节因子，对海马学习记忆的调解中起重要作用，NO可以通过激活鸟苷酸环化酶(GC)进而促进谷氨酸(Glu)的释放，促进学习记忆过程。有研究指出Glu能系统和NO系统的异常可能是造成AD学习记忆功能障碍的因素之一〔2，3〕。本实验通过观察L-NMMA对AD模型大鼠的海马DG区Glu含量及空间学习记忆能力的影响，探讨AD大鼠模型中NO对学习记忆的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1动物模型的制备 18只成年雌性SD大鼠，体重(270±30)g，随机分成3组：假手术组(sham)、AD模型(AD)组和AD+L-NMMA(L-NMMA)组，每组6只。采用双侧卵巢摘除加D-半乳糖腹腔注射的方法来制备AD模型大鼠，方法如下：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)进行麻醉，待大鼠深度麻醉后固定在手术台上，大鼠取仰卧位。在脐与耻骨前缘的中点处，向后沿着腹底壁的正中线，切开2～3 cm的切口，摘除双侧卵巢。手术后第2天开始，每天对大鼠腹腔注射D-半乳糖(60 mg/kg)，持续6 w。sham组大鼠也进行开腹术，但是找到卵巢之后不进行摘除，术后第2天开始，每天进行腹腔注射生理盐水，持续6 w。

1.2海马DG微量透析探针的埋入及Glu含量的测定 AD模型制备成功后的第2天，将大鼠麻醉固定于脑立体定位仪上，将透析所用的外套管，插入到DG上的0.1 cm处(定位坐标为：前囟向后退0.34 cm，正中线旁开距离为0.22 cm，深度为0.25 cm)，用牙科水泥将外套管固定在大鼠颅骨表面。将自制的微量透析探针经过外套管，垂直插入大鼠海马DG，并与外套管固定牢靠。探针前端超出套管的长度为0.1 cm，其前端的乙酸纤维素半透膜外径为0.02 cm，分子量小于50 000 D的物质可被滤过，将微量注射所用的玻璃微管，通过连接头，固定于探针表面到达DG。在大鼠手术恢复1 d之后，将微量透析探针与微量泵相连接(ESP-64，日本Eicom公司)向透析探针内注入人工脑脊液灌流(147 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2.3 mmol/L CaCl2，pH6.5；1.5 μl/min)，连接大鼠稳定30 min后开始收集微量透析样本，每只动物收集3个管，每管样本收集10 min。透析样本的第一次收集结束之后，开始进行为期5 d的Morris水迷宫试验(MWM)，并在每天训练结束后按上述方法对动物进行微量透析。进行高效液相色谱分析时，将3 μl OPA(4 mmol/L)诱导剂与12 μl样本在室温下充分混合，反应2.5 min后抽取10 μl反应液，用微量注射针将反应液推入生物活性物质微量分析系统 (HTEC-300，日本Eicom公司)中，然后再通过其高效液相色谱分离柱、电化学检测器，得到样本中Glu的含量。

1.3MWM实验 应用MWM(上海吉量)对大鼠空间学习记忆能力进行检测。此部分实验包括定位航行实验(4 d)和空间探索实验(1 d)。在训练的前4 d，每天将大鼠分别从不同入水点放入水池，如果大鼠在规定时限(120 s)内能够找到并爬上站台，则其逃避潜伏期为自入水后到爬上站台为止所用时间；若不能则其逃避潜伏期计为120 s。在第5天的空间探索试验中，撤去隐藏站台后将大鼠从同一入水点放入水池，记录大鼠在120 s内穿越原站台区的次数。

1.4DG区微量注射药物 非选择性NOS抑制剂L-NMMA(美国Sigma公司)用改良Riger液配成1 μg/μl的溶液，-4℃保存。每天进行MWM训练之前以1 μl/min的速度向海马DG注射L-NMMA(L-NMMA组)或改良Riger液(sham组或AD组)，注入时程为1 min，30 min后开始进行MWM训练。

1.5统计学方法 采用Prism3.0软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组海马DG Glu水平比较 与sham组〔(1.80±0.58)μmol/L〕比较，AD组大鼠海马DG的细胞外液中Glu的基础含量〔(1.63±0.79)μmol/L〕差异无统计学意义(P>0.05)，L-NMMA组Glu含量〔(2.23±0.72)μmol/L〕较AD组有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组空间学习能力比较 随着训练天数的增加，除AD组第2天差异无统计学意义外，3组大鼠逃避潜伏期均逐渐显著减小(P<0.05)。第2～4天，AD组逃避潜伏期明显大于sham组(P<0.05)；L-NMMA组逃避潜伏期明显低于AD组(P<0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期比较

与第1天相比： 1)P<0.05；与sham组相比：2)P<0.05；与AD组相比:3)P<0.05

2.3各组空间记忆能力比较 AD组〔(3.67±0.82)次/120 s〕和L-NMMA组〔(7.83±1.47)次/120 s〕穿越原站台区的次数明显少于sham组〔(11.17±1.17)次/120 s，均P<0.05〕，L-NMMA组穿越原站台区的次数明显高于AD组(P<0.05)。

2.4各组Glu含量变化比较 与训练前比较，除第1天差异无统计学意义外AD组Glu含量随训练天数的增加而逐渐显著增加(均P<0.05)，L-NMMA组Glu含量和sham组的变化趋势一样，均随训练天数的增加Glu含量呈先增加后又降低的趋势，而且与训练前比较，sham组和L-NMMA 组Glu含量在训练的第2、3天时均明显增高(P<0.05)。与AD组比较，L-NMMA组第4、5天Glu含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组Glu含量变化比较

与训练前相比:1)P<0.05；与AD组相比：2)P<0.05

3 讨 论

认知功能障碍是AD最主要的临床表现之一，而大脑中负责认知功能的基础部位是海马，同时，海马也是中枢神经系统中负责学习记忆的关键结构。NO是中枢神经系统中重要的气体型神经递质，海马中的NO对学习和记忆功能具有促进作用〔4，5〕。抑制NO系统可有效改善认知记忆的受损〔6〕，也可以减弱离体培养的神经元的退行性改变〔2〕，在AD大鼠脑内NOS的水平明显降低〔3〕，而激活NO系统后老龄大鼠的学习记忆得到明显改善〔7〕。本实验结果表明在训练前给AD模型大鼠微量注射L-NMMA后，明显改善AD大鼠空间学习记忆障碍，AD大鼠海马DG区内NO可损害空间学习和记忆功能，这与正常大鼠状况相反。AD学习和记忆受损的重要原因之一是兴奋性氨基酸-Glu的神经毒性作用，其机制可能是Glu过度活化膜上的NMDA受体，激活突触内的Ca2+通道使Ca2+大量释放，导致神经元、少突胶质细胞中毒〔8〕。海马DG区内的NO可以作为逆行信使通过增加局部的Glu水平来促进主动回避学习记忆过程〔9〕。本实验结果提示Glu在局部大量积聚而影响DG区正常的突触传递，对大鼠学习记忆功能产生影响。本实验结果显示AD大鼠的学习记忆损伤可能与海马内NO促进了氨基酸类神经递质Glu的过度生成而影响了突触的正常传递有关，其机制还需进一步研究。

4 参考文献

1姜 霞.空间学习对AD模型鼠海马突触可塑性及神经发生的影响〔D〕.武汉：华中科技大学，2012.

2Xie Z，Wei M，Morgan TE，etal.Peroxynitrite mediates neurotoxicity of amyloid β-peptide 1-42-and lipopolysaccharide-activated microglia〔J〕.Neurosci，2002；22(9)：3484-92.

3Xian YF，Su ZR，Chen JN，etal.Isorhynchophylline improves learning and memory impairments induced by D-galactose in mice〔J〕.Neurochem Int，2014；76：42-49.

4Harooni HE，Naghdi N，Sepehri H，etal.The role of hippocampal nitric oxide (NO) on learning and immediate，short-and long-term memory retrieval in inhibitory avoidance task in male adult rats〔J〕.Behav Brain Res，2009；201(1)：166-72.

5Majlessi N，Choopani S，Bozorgmehr T，etal.Involvement of hippocampal nitric oxide in spatial learning in the rat〔J〕.Neurobiol Learn Mem，2008；90(2)：413-9.

6Pitsikas N.The role of nitric oxide in the object recognition memory〔J〕.Behav Brain Res，2015；285:200-7.

7Komsuoglu Celikyurt I，Utkan T，Ozer C，etal.Effects of YC-1 on learning and memory functions of aged rats〔J〕.Med Sci Monit Basic Res，2014；21(20)：130-7.

8Ruiz A，Matute C，Alberdi E.Intracellular Ca2+release through ryanodine receptors contributes to AMPA receptormediated mitochondrial dysfunction and ER stress in oligodendrocytes〔J〕.Cell Death Dis，2010；1：1-9.

9Wang S，Pan DX，Wang D，etal.Nitric oxide facilitates active avoidance learning via enhancement of glutamate levels in the hippocampal dentate gyrus〔J〕.Behav Brain Res，2014；271：177-83.