TLR-MyD88通路在COPD炎症反应中的作用及莱菔硫烷的抗感染效果

王 婧 王 敏 范玉敏 王 燕

(甘肃中医药大学继续教育学院,甘肃 兰州 730000)

研究发现，下呼吸道病原菌定植可能是导致慢性阻塞性肺病(COPD)患者气道生理功能失调和炎症反应的主要原因〔1〕。肺泡巨噬细胞是介导COPD气道炎症的主要细菌之一，其分泌出的细胞因子可调控局部免疫反应，在炎症反应中发挥重要作用〔2〕。TLR4是肺泡巨噬细胞表面病原菌识别受体，被激活后可启动MyD88依赖的信号通路，激活核因子(NF)-κB、MAPKs，引发炎症反应，在免疫屏障和气道炎症中发挥关键作用〔3〕。莱菔硫烷是从十字花科植物中提取的成分，具有抗癌、抗感染作用，可抑制NF-κB通路活化，可能对COPD的炎症反应有抑制作用〔4〕。COPD患者肺功能偏低，难以通过支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞，而外周血单核细胞源性巨噬细胞的生物学功能与其相似，可替代肺泡巨噬细胞作为体外研究模型〔5〕。本次研究采用外周血单核细胞源性巨噬细胞探讨TLR-MyD88信号通路在COPD中的作用及莱菔硫烷的抗感染效果。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2016年1～12月酒泉市人民医院住院患者中COPD稳定期患者64例为COPD组，男44例，女20例，年龄57～89岁，平均(72.69±7.01)岁；中度44例、重度14例、极重度6例。选取同年龄段肺功能正常的体检者60名为非COPD组，男40名，女20名，年龄58～77岁，平均(70.05±5.69)岁。本研究通过医院伦理委员会审批，入选患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂 DMEM细胞培养基、集落刺激因子、胰蛋白酶购于上海慧颖生物科技有限公司；莱菔硫烷购于上海宾智生物科技有限公司；TLR4、MyD88 PCR扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；兔抗人Tlr4多克隆抗体、鼠抗人MyD88多克隆抗体、鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购于上海远慕生物科技有限公司。

1.3巨噬细胞培养及鉴定 抽取两组受试者空腹外周静脉血15 ml，抗凝处理后梯度离心分离单核细胞，按4×109/L密度接种到24孔板中，CO2孵箱中常规培养2 h，收集贴壁细胞放入含终浓度为3 μg/L集落刺激因子的DMEM完全培养基，置于37℃ CO2孵箱中培养10 d。取对数期单核细胞和巨噬细胞，胰酶消化后，2 000 r/min离心10 min，弃去上清，滴加AO/EB溶液悬浮细胞，荧光显微镜下观察细胞形态。同时采用流式细胞术检测单个核细胞和巨噬细胞表面CD14表达情况。

1.4分组与干预 将COPD组的巨噬细胞分4组：空白对照组、脂多糖组(终浓度为1 mg/L的脂多糖干预)、莱菔硫烷组(终浓度为30 μmol/L的莱菔硫烷干预)、联合干预组(终浓度为1 mg/L的脂多糖和30 μmol/L的莱菔硫烷联合干预)，干预时间根据基因、蛋白检测的不同分为12 h和36 h。非COPD组巨噬细胞不给予任何干预，细胞密度4×106/L。

1.5实时荧光定量PCR检测 提取巨噬细胞总RNA，逆转录得到cDNA。TLR4上游引物：5′-TCCTACTACGGTCCTCCTAC-3′，下游引物：5′-AGTCCAGGTCCAAGAACGG-3′，扩增长度182 bp；MyD88上游引物：5′-TCGGTCCGACCTCGTTCCAT-3′，下游引物：5-CCGTCGATTTACGGAGTTCT-3′，扩增长度85 bp；内参GADPH上游引物：5′-CGTGGCAGTTCCGACTCTTG-3′，下游引物：5′-ACCACTTCTGCGGTCACCTA-3′，扩增长度127 bp。扩增条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法检测TLR4、MyD88基因表达情况。

1.6Western印迹检测 提取细胞总蛋白，测定浓度后取50 μg样品行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，重复2次，湿法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)，室温下脱脂奶粉封闭1 h，滴加兔抗人TLR4多克隆抗体(1∶1 000)、鼠抗人MyD88多克隆抗体(1∶1 000)，内参为鼠抗人β-actin抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，滴加HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)、羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室温下反应2 h。电化学发光法(ECL)显色，检测各特异性条带灰度值。

1.7酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6浓度 收集各组巨噬细胞培养液上清，-80℃保存待测，ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6浓度，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.8统计学分析 应用SPSS6.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1细胞形态学观察及流式细胞术鉴定 外周血单核细胞体积较小，呈圆形，细胞核位于中央；集落刺激因子作用后细胞体积明显增加，多为圆形，少数周边有板形突起，颗粒较多，呈现巨噬细胞形态学特征。见图1。流式细胞术检测显示，外周血单核细胞中CD14表达量为(89.61±5.97)%，明显高于巨噬细胞中的(42.15±9.30)%，差异有统计学意义(P<0.01)，说明单核细胞成功诱导为巨噬细胞。

2.2各组巨噬细胞TLR4、MyD88 mRNA表达情况 非COPD组、空白对照组、脂多糖组、莱菔硫烷组、联合干预组TLR4 mRNA相对表达量分别为：1.00±0.00、3.65±0.49、5.69±0.95、1.34±0.52、3.10±0.61；MyD88 mRNA相对表达量分别为：1.00±0.00、1.87±0.30、3.31±1.75、1.15±0.52、1.62±0.81。基础状态下COPD组巨噬细胞中TLR4、MyD88 mRNA表达水平均明显高于非COPD组，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD组巨噬细胞经脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；莱菔硫烷组、联合干预组TLR4、MyD88 mRNA表达水平明显低于脂多糖组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。莱菔硫烷组TLR4、MyD88 mRNA表达水平与非COPD组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组巨噬细胞TLR4、MyD88 蛋白表达情况 非COPD组、空白对照组、脂多糖组、莱菔硫烷组、联合干预组TLR4蛋白相对表达量分别为：0.37±0.05、0.56±0.13、0.76±0.17、0.36±0.10、0.44±0.21；MyD88 蛋白相对表达量分别为：0.69±0.35、1.22±0.76、1.75±0.71、0.73±0.45、0.88±0.36。COPD组巨噬细胞中TLR4、MyD88 蛋白表达水平均明显高于非COPD组，差异有统计学意义(P<0.05)；脂多糖组TLR4、MyD88 蛋白表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；莱菔硫烷组、联合干预组TLR4、MyD88 蛋白表达水平明显低于脂多糖组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。莱菔硫烷组TLR4、MyD88 蛋白表达水平与非COPD组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 荧光显微镜下观察单核细胞和巨噬细胞形态学特征(×400)

1.非COPD组；2.空白对照组；3.脂多糖组；4.莱菔硫烷组；5.联合干预组图2 各组巨噬细胞TLR4、MyD88 蛋白电泳

2.4各组巨噬细胞TNF-α、IL-6分泌情况 非COPD组、空白对照组、脂多糖组、莱菔硫烷组、联合干预组巨噬细胞培养液上清中TNF-α浓度(μg/L)分别为：20.15±3.09、32.90±5.61、48.77±5.37、21.64±4.25、32.98±4.33；IL-6浓度(μg/L)分别为：32.91±5.47、44.12±5.69、55.71±6.35、28.68±4.80、34.16±5.49。COPD患者TNF-α、IL-6浓度均明显高于非COPD组，差异有统计学意义(P<0.05)；脂多糖组TNF-α、IL-6浓度明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；莱菔硫烷组、联合干预组TNF-α、IL-6浓度明显低于脂多糖组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；莱菔硫烷组TNF-α、IL-6浓度与非COPD组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

COPD患者下呼吸道存在多种微生物定植，可引发持续的气道炎症反应，其中肺泡巨噬细胞发挥重要作用。肺泡巨噬细胞具有包括抗原呈递、调节炎性因子分泌、吞噬在内的多种生物学功能〔6〕。激活肺泡巨噬细胞可释放大量炎性因子及蛋白酶，同时汇聚炎症细胞，参与炎性反应、组织损伤及修复。相关研究显示，COPD患者肺泡巨噬细胞吞噬细菌功能障碍，是下呼吸细菌定植的主要诱因〔7〕。单核细胞源性巨噬细胞在表型和生理功能方面与肺泡巨噬细胞相似，可作为肺泡巨噬细胞研究模型。本次研究通过流式细胞术检测显示，外周血单核细胞表面CD14表达水平较高，诱导成巨噬细胞后CD14表达水平明显下降，结合荧光显微镜下形态学观察，提示成功诱导为巨噬细胞。

TLR4作为膜识别受体，多表达于免疫细胞、上皮细胞和内皮细胞，其中以巨噬细胞和树突细胞最为多见，脂多糖是TLR4的主要配体。配体激活TLR4后，可经MyD88依赖途径传导，激活IL-1、TNF-6受体相关因子，介导炎性因子转录。相关研究发现，脂多糖刺激气道上皮细胞中TLR4表达，是COPD发病的主要因素之一〔5〕。脂多糖可通过TLR-MyD88信号通路提高大鼠肺泡巨噬细胞中IL-6、TNF-α等细胞因子水平，在肺炎的发生、发展中发挥调控作用〔8〕。本研究提示COPD患者气道可能在定植菌长期刺激下，巨噬细胞经表面TLR4识别MyD88信号通路，诱发炎症反应并维持炎症状态。脂多糖刺激后，TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达水平和TNF-α、IL-6分泌量均增加，提示脂多糖刺激经TLR-MyD88信号通路加重炎症反应，该信号通路可能参与COPD的炎症过程。

莱菔硫烷易溶于水，存在于甘蓝、西兰花、萝卜等十字花科蔬菜的根、茎、种子中，可诱发肿瘤细胞凋亡和清除，具有抗癌作用，是癌症治疗研究的新热点。近年来研究发现，莱菔硫烷还具有较强的抗炎、抗氧化作用，可通过抑制小鼠前B细胞中TLR4聚集，抑制炎症反应〔9〕。本研究提示莱菔硫烷可通过抑制TLR-MyD88信号通路减少下游炎性因子的释放并发挥抗感染作用。

4 参考文献

1张 淼.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织和血清游离免疫球蛋白轻链的表达及其意义〔D〕.徐州：徐州医学院，2013.

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3高 瞻.中性粒细胞性哮喘和COPD患者诱导痰中性粒细胞炎症程度的比较研究〔D〕.重庆：第三军医大学，2015.

4张慧琴.莱菔硫烷对脂肪细胞的代谢调控作用及分子机制研究〔D〕.宁波：宁波大学，2015.

5古 辉，徐小彭，钟获华，等.沙美特罗/福替卡松对中重度慢阻肺患者稳定期的疗效观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(2)：225-8.

6刘 博.血必净注射液对COPD急性加重期合并呼吸衰竭患者的临床疗效及预后分析〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(1)：83-4，86.

7王秋颖，徐丹丹，郭晓慧，等.慢性阻塞性肺疾病患者运动耐量与系统性炎症水平的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(21)：5385-6.

8高增艳.红霉素对COPD大鼠组蛋白云乙酰化酶2活性与糖皮质激素抵抗的影响及机制〔D〕.郑州：郑州大学，2013.

9李晓川.呼吸兴奋剂协同无创正压通气治疗COPD并肺性脑病的疗效分析〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(3)：292-3，297.