苜蓿轮作玉米小麦土壤浸提液对苜蓿种子萌发和幼苗生理及生长的影响

尹国丽，吴芳，陶茸，师尚礼，蔡卓山

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州 730070)

近年来，随着紫花苜蓿(Medicagosativa)自毒作用研究的不断深入，已有学者指出苜蓿是自毒效应较强的牧草之一，其植株向环境中释放的化感物质是造成苜蓿连作障碍的重要原因[1-2]。许多研究表明紫花苜蓿连作后短期间隔重茬种植，后茬苜蓿长势差、植株细弱矮小，甚至很难建植成功，严重制约着苜蓿的继续生长和农地资源的再次利用[3-6]。联系生产实践，大力发展和广泛推行合理的草田轮作体系是解决上述问题的有效途径之一。大量的生产实践证明苜蓿与作物轮作技术，有利于增加土壤速效养分、改善土壤环境、缓解或解除自毒作用、防治杂草与病虫害、从而提高后茬作物产量与品质[7-10]。Tucker等[11]指出苜蓿地翻耕后连续3年种植小麦(Triticumaestivum)，第2年小麦产量最高。Stickler等[12]也发现苜蓿地翻耕后轮作玉米(Zeamays)，第2年玉米产量高于第1年。杨珍奇等[13]研究表明和常规麦田连种2年冬小麦相比，苜蓿茬地连种2年冬小麦能增加小麦的全氮、粗蛋白和全糖含量。李军等[14]研究得出苜蓿地翻耕后进行轮作，土壤水分恢复深度随后茬作物种植年限的延长而加深。Li 等[15]在黄土高原半湿润区的研究亦表明，与小麦连作相比，苜蓿-小麦-玉米循环后土壤全氮和速效氮含量均显著增加。宋丽萍等[16]研究指出在黄土高原半干旱区，苜蓿-玉米和苜蓿-小麦轮作模式能形成良好的土壤结构，改善土壤的渗透性能，提高土壤物理质量。也有研究表明苜蓿-小麦轮作系统在甘肃有一定的种植历史，且后茬小麦不会受到苜蓿毒性的影响[17]。

草田轮作制度在生产中应用广泛，将苜蓿纳入轮作体系对提高后茬作物产量，维持生态系统平衡和功能恢复发挥了重要作用[18]。近年来，国内关于紫花苜蓿和玉米、小麦轮作的研究主要集中于对后茬作物产量、品质以及对土壤微生物群落、养分变化等性状影响的方面，而针对河西走廊地区多龄紫花苜蓿轮作玉米、小麦的土壤浸提液对苜蓿种子萌发、幼苗生理生长的研究鲜有报道[17,19]。鉴于此，本试验以5年紫花苜蓿根区土壤浸提液作对照(CK)，以5年紫花苜蓿地轮作玉米、小麦第1年、第2年的玉米、小麦根区土壤作为浸提液提取材料，采用不同浓度处理“甘农3号”紫花苜蓿(M.sativacv. Gannong No.3)种子及幼苗，通过测定发芽率、胚根长、胚芽长等幼苗生长参数和可溶性糖(SS)、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等幼苗生理指标进行初步探索轮作玉米、小麦土壤浸提液对苜蓿种子萌发及幼苗生长，生理影响的化感效应，为合理建立苜蓿人工草地及维护其系统的生产力性稳定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在甘肃省武威市凉州区黄羊镇甘肃农业大学牧草站进行。该试验站位于甘肃河西走廊东端，地处103°5′ E，37°30′ N，属冷温带干旱区，是典型的大陆性气候，日照充足，春季多风沙，夏季有干热风。平均海拔1776 m，降水年际变化不大，但季节变化较大，多年平均降水量160 mm左右，主要集中在7、8、9月。年蒸发量2400 mm，≥0 ℃年积温3513.4 ℃，≥10 ℃年积温2985.4 ℃。全年无霜期156 d，绝对无霜期118 d，年日照时数2945 h。土壤以荒漠灌淤土为主，粉沙壤质，土层深厚，地势平坦，灌溉条件好。

1.2 供试材料

紫花苜蓿品种为“甘农3号”，小麦品种为杂交种宁春4号(T.aestivumcv. Ningchun No.4)，玉米品种为杂交种陇单4号(Z.mayssp. Longdan No.4)。

1.3 试验设计

试验地位于甘肃省武威市黄羊镇甘肃农业大学牧草站。选取5年(种植5年)紫花苜蓿地进行草田轮作试验。轮作区2014年3月进行翻耕，对照区(control，CK)不翻耕。试验采用完全随机区组设计，轮作区设3次重复，各重复区面积均为4 m×5 m。2014年和2015年4月15日播种玉米和小麦，播种前施磷二胺225 kg·hm-2和尿素225 kg·hm-2作为基肥，每个轮作区施基肥一致，每年入冬之前灌1次冬水。玉米穴播，1穴2粒，株距22 cm，出苗后保留生长较好的一株；小麦沟播，播种量为150 kg·hm-2，行距20 cm。轮作第1年(2014年)，紫花苜蓿-小麦区简称AW(alfalfa-wheat)，紫花苜蓿-玉米区简称AC(alfalfa-corn)；轮作第2年(2015年)，紫花苜蓿-小麦-小麦区连作简称AWW(alfalfa-wheat-wheat)，紫花苜蓿-玉米-玉米区连作简称ACC(alfalfa-corn-corn)。

1.4 土样采集

于2014年3月采集5年紫花苜蓿地的根区土壤，2014年、2015年小麦收获季7月下旬、玉米收获季9月下旬，用土钻分别取0～30 cm土层玉米、小麦的根区土壤，各轮作处理按照“5点取样法”，将所得土样装入塑料袋，内外附上标签，写明采样地点、采样日期和采样深度。除去枯枝落叶，挑出植物细根，均匀混合后，过2 mm筛，带回实验室存放于4 ℃冰箱中备用。

1.5 测定方法

1.5.1土壤浸提液制备 分别称取10，50，160 g 风干的苜蓿、玉米、小麦根区土壤放入洁净的三角瓶并加入1 L蒸馏水，封口，在30 ℃超声波中萃取30 min；150 r·min-1、25 ℃振荡浸提 24 h后，用定性滤纸将浸提液过滤，最后将浸提液定容，分别配制成10，50，160 g·L-1溶液，2 ℃条件下避光保存。

1.5.2室内种子发芽试验处理与测定指标 发芽测试供试种子为“甘农3号”紫花苜蓿，由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供。选取外观一致、籽粒饱满的种子，用78%的酒精浸泡消毒1 min，蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸干。采用培养皿纸上发芽法，洁净的培养皿(直径9 cm)铺双层滤纸，每皿均匀摆放50粒苜蓿种子，每皿各加5 mL土壤浸提液。用5年苜蓿根区土壤浸提液处理作对照(CK)，各处理设置3个浓度梯度(10，50，160 g·L-1)，3次重复。培养皿加盖，置于BIC-400光照培养箱中，25 ℃，光周期14 h，光强6000 lx，暗周期10 h，相对湿度75%。每天补充适量浸提液以保持培养皿内滤纸的湿度。测定指标：参照李家义等[20]的方法以胚根突破种皮，伸出1 mm为发芽标准，第4天进行初次计数。第7天测定苜蓿种子发芽率，第10天每皿随机取10株幼苗，在坐标纸上测胚芽和胚根长。计算不同处理后的发芽势和发芽率等指标[21]：

发芽率=(发芽终止时全部正常发芽的种子/供试种子数)×100%

参照Williamson等[22]的方法，计算化感作用效益指数(RI)：

RI=1-C/T(T≥C)

RI=T/C-1(T

式中：T为测试项目的处理值；C为对照值；当RI>0时，表示存在促进效应；当RI<0时，表示存在抑制效应。

1.5.3对幼苗生理指标测定 取不同浓度土壤浸提液10 mL加入铺有2层定性滤纸的培养皿中，每个处理3次重复，培养皿均匀摆放50粒苜蓿种子、萌发过程中适当补充土壤浸提液，使滤纸保持湿润，待每个培养皿中幼苗约0.5 g时，采用培养钵进行沙培，每盆定植10株，然后转入BIC-400光照培养温室中[光照14 h·d-1，光通量密度400 μmol·m-2·s-1，昼夜温度分别为(25±1)和(20±1) ℃，相对湿度(65±5)%左右]，试验组加入轮作处理不同浓度(10，50，160 g·L-1)的土壤浸提液15 mL，对照组加入15 mL苜蓿根区土壤浸提液，各个处理的浸提液均用1/2 Hoagland营养液配制，为保证浸提液浓度稳定，每隔2 d更换一次浸提液，每个处理设置3次重复，生长30 d后采集叶片测定相关生理指标。测定的指标包括：可溶性糖(soluble sugar，SS)含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法测定，可溶性蛋白(protein，pr)含量采用考马斯亮兰G-250法测定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定[23-24]；抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性参照Nakano 等[25]的方法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GPX)活性参照Urbanek 等[26]的方法测定。

1.6 数据统计分析

应用Excel 2007对数据进行整理，采用SPSS 16.0进行方差分析，用Duncan法在0.05水平上进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 土壤浸提液对苜蓿种子萌发及幼苗生长的影响

2.1.1土壤浸提液对种子发芽率及化感指数的影响 不同轮作模式的土壤浸提液对苜蓿种子萌发有不同的影响，受体苜蓿种子的发芽率均显著高于CK(图1)，RI均大于0(图2)，表明轮作玉米、小麦后，其根区土壤浸提液对受体苜蓿种子均存在促进作用。每种浓度处理下，AWW的种子发芽率均达最高值，较CK分别显著提高了29.22%，68.09%，54.24%(P<0.05)。当土壤浸提液浓度为10 g·L-1时，AWW的苜蓿种子发芽率较AC、ACC、AW显著提高了16.46%，15.08%，15.04%(P<0.05)；土壤浸提液浓度为50 g·L-1时，ACC和AW的苜蓿种子发芽率均显著高于AC(P<0.05)，比AC分别增加了4.50%，2.44%；AWW的苜蓿种子发芽率均显著高于AC、ACC、AW，分别提高了9.40%，4.69%，6.81%；土壤浸提液浓度为160 g·L-1时，轮作土壤浸提液处理的种子发芽率显著高于10和50 g·L-1浓度处理下的种子发芽率，且AC、ACC、AW、AWW的种子发芽率较CK显著提高了41.23%，49.63%，40.51%，54.24%(P<0.05)。从以上结果看出轮作小麦2年效果最佳，对受体苜蓿种子萌发促进作用最强。

图1 不同浓度土壤浸提液对种子发芽率的影响Fig.1 Effects of soil extracts with different concentration on seed germination rate

图2 不同浓度土壤浸提液对发芽率化感指数的影响Fig.2 Effects of soil extracts with different concentration on allelopathic index of germination rate

不同小写字母表示轮作处理和对照间差异显著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters indicate significant differences between rotation treatments at the 0.05 level. The same below.

2.1.2土壤浸提液对幼苗胚芽长、胚根长的影响 轮作处理的土壤浸提液显著促进了受体苜蓿幼苗胚芽的生长(图3)，与CK差异显著(P<0.05)，在AC、AW、AWW轮作模式下，随着土壤浸提液浓度的增加，胚芽相应伸长，促进效果愈加明显。在相同土壤浸提液浓度处理下，AWW的胚芽长显著高于AC、ACC、AW(P<0.05)，且浓度为160 g·L-1时，轮作土壤浸提液处理下的胚芽长高于10和50 g·L-1浓度处理下的幼苗胚芽长，且AC、ACC、AW、AWW的幼苗胚芽长较CK显著提高了62.73%，81.60%，76.30%，173.12%(P<0.05)。

和CK相比，各轮作模式的土壤浸提液显著促进了苜蓿幼苗胚根的生长(P<0.05)(图4)，且随土壤浸提液浓度的增加，促进效应更明显。当土壤浸提液浓度为最高(160 g·L-1)时，AC、ACC、AW、AWW处理下幼苗胚根长较CK显著提高了87.10%，111.60%，85.64%，119.33%(P<0.05)。相同土壤浸提液浓度处理下，ACC、AWW的胚根长显著高于AC、AW(P<0.05)，而ACC和AWW的胚根长未达到显著差异(P>0.05)。

图3 不同浓度土壤浸提液对幼苗胚芽长的影响Fig.3 Effects of soil extracts with different concentration on epicotyl length of alfalfa seedlings

图4 不同浓度土壤浸提液对幼苗胚根长的影响Fig.4 Effects of soil extracts with different concentration on radical length of alfalfa seedlings

2.2 土壤浸提液对苜蓿幼苗生理的影响

2.2.1土壤浸提液对幼苗可溶性糖(SS)含量的影响 与CK相比，轮作土壤浸提液均显著提高了苜蓿幼苗的SS含量(P<0.05)(图5)，且轮作小麦土壤浸提液处理后的苜蓿幼苗SS含量显著高于轮作玉米的SS含量(P<0.05)。相同土壤浸提液浓度处理下，各轮作模式的幼苗SS含量均差异显著，且含量大小顺序为AWW>AW>ACC>AC，其中当土壤浸提液浓度为10 g·L-1时，AWW的幼苗SS含量达最大值，为26.11 mmol·g-1，较AC、ACC、AW、CK显著增加了395.45%，210.10%，109.38%，728.89%；浓度为50 g·L-1时，AWW的幼苗SS含量最大，较AC、ACC、AW显著提高了502.44%，361.68%，83.23%；浓度为160 g·L-1时，AWW的幼苗SS含量较AC、ACC、AW分别显著增加了218.80%，182.58%，30.88%。

2.2.2土壤浸提液对幼苗可溶性蛋白含量的影响 随土壤浸提液浓度的增加，AC、ACC、AWW和CK的苜蓿幼苗可溶性蛋白含量呈下降趋势(图6)，而AW的幼苗可溶性蛋白含量呈上升趋势。当土壤浸提液浓度为10 g·L-1时，ACC的幼苗可溶性蛋白含量达最高值，为4.86 mg·g-1，较CK、AC、AW、AWW分别显著增加了11.72%，4.52%，15.99%，12.76%(P<0.05)。当土壤浸提液浓度分别为50和160 g·L-1时，AC、ACC、AW、AWW的幼苗可溶性蛋白含量均显著低于CK(P<0.05)，土壤浸提液浓度为160 g·L-1时,ACC达最低值，为4.08 mg·g-1，较CK降低了5.23%。

2.2.3土壤浸提液对幼苗丙二醛(MDA)含量的影响 当土壤浸提液浓度增加时，AC和ACC能提高苜蓿幼苗的MDA含量(图7)，AW和AWW的幼苗MDA含量的变化趋势为先下降后上升，CK的MDA含量呈下降趋势。当土壤浸提液浓度相同时，轮作土壤浸提液处理下幼苗的MDA含量差异显著(P<0.05)，且浓度分别为50和160 g·L-1时，AC、ACC、AW、AWW的幼苗MDA含量均显著高于CK(P<0.05)，ACC的MDA含量达最高值，分别为11.58和13.42 μmol·g-1，较CK增加了414.61%，475.08%；土壤浸提液浓度为10 g·L-1时，AC、ACC、AW、AWW的幼苗MDA含量较CK分别显著下降了32.85%，71.72%，16.61%，37.91%(P<0.05)。

2.2.4土壤浸提液对幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 不同轮作模式和CK土壤浸提液处理下，苜蓿幼苗的SOD活性变化趋势一致(图8)，均随着土壤浸提液浓度的增加而SOD活性显著增强(P<0.05)。当土壤浸提液浓度分别为10和50 g·L-1时，轮作土壤浸提液处理的幼苗SOD活性显著低于CK(P<0.05)，ACC达最低值，分别为4.81和9.19 U·g-1FW，比CK分别降低了72.32%，81.97%；当土壤浸提液浓度为160 g·L-1时，AC和ACC的幼苗SOD活性显著低于CK(P<0.05)，ACC达最低值，为21.57 U·g-1FW，较CK下降了62.79%，AW幼苗的SOD活性较CK显著提高了17.25%(P<0.05)。

图5 不同浓度土壤浸提液对幼苗可溶性糖含量的影响Fig.5 Effects of soil extracts with different concentration on soluble sugar contents of alfalfa seedlings

图6 不同浓度土壤浸提液对幼苗可溶性蛋白含量的影响Fig.6 Effects of soil extracts with different concentration on soluble protein contents of alfalfa seedlings

图7 不同浓度土壤浸提液对幼苗丙二醛含量的影响Fig.7 Effects of soil extracts with different concentration on MDA contents of alfalfa seedlings

图8 不同浓度土壤浸提液对幼苗超氧化物歧化酶活性的影响 Fig.8 Effects of soil extracts with different concentration on SOD activity of alfalfa seedlings

2.2.5土壤浸提液对幼苗过氧化氢酶(CAT)活性的影响 随着土壤浸提液浓度的增大，AC、ACC苜蓿幼苗的CAT活性增强(图9)，而AW、AWW的幼苗CAT活性减弱。相同土壤浸提液浓度处理下，AC、ACC、AW、AWW的幼苗CAT活性差异显著(P<0.05)，且当土壤浸提液浓度分别为50和160 g·L-1时，AC和ACC的CAT活性较CK分别显著增强了128.21%，254.79%，43.01%，91.64%(P<0.05)；当土壤浸提液浓度分别为10和50 g·L-1时，AW和AWW的CAT活性显著强于CK(P<0.05)，较CK分别增强了10.71%，14.67%，188.42%，292.53%。

2.2.6土壤浸提液对幼苗抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响 随着土壤浸提液浓度的增加，AC的苜蓿幼苗APX活性显著下降(P<0.05)(图10)，而ACC和AWW的幼苗APX活性显著增强(P<0.05)，AW的幼苗APX活性先下降后增强。当土壤浸提液浓度分别为10 g·L-1时，各轮作土壤浸提液处理下苜蓿幼苗的APX显著低于CK(P<0.05)，当浓度为50 g·L-1时轮作土壤浸提液处理的苜蓿幼苗APX显著强于CK(P<0.05)，当浓度为160 g·L-1时ACC的幼苗APX活性较CK显著增加了49.30%，而AC、AW和AWW的幼苗APX活性较CK显著降低了27.85%，71.25%，19.78%(P<0.05)。

图9 不同浓度土壤浸提液对幼苗过氧化氢酶活性的影响 Fig.9 Effects of soil extracts with different concentration on CAT activity of alfalfa seedlings

图10 不同浓度土壤浸提液对幼苗抗坏血酸过氧化物酶活性的影响Fig.10 Effects of soil extracts with different concentration on APX activity of alfalfa seedlings

2.2.7土壤浸提液对幼苗谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)

图11 不同浓度土壤浸提液对幼苗谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响Fig.11 Effects of soil extracts with different concentration on GPX activity of alfalfa seedlings

活性的影响 随着土壤浸提液浓度的增加，AC的苜蓿幼苗GPX活性先减弱后增强(图11)，ACC的幼苗GPX活性先增强后减弱，而AW、AWW的幼苗GPX活性显著增强(P<0.05)。当土壤浸提液浓度分别为50 g·L-1时，轮作土壤浸提液处理的苜蓿幼苗GPX活性显著低于CK(P<0.05)，AC达最低值，为0.27 mmol H2O2·min-1·mg-1，较CK降低了52.13%；当浓度为160 g·L-1，轮作土壤浸提液处理下苜蓿幼苗的GPX活性显著低于CK(P<0.05)，ACC达最低值，为0.48 mmol H2O2·min-1·mg-1，较CK降低了36.61%。

3 讨论

植物自毒作用是活体植物通过淋溶、挥发、残体分解和根系分泌向环境中释放某些化学物质，从而对自身或同种植物的生长和发育产生有害的作用[1]。自毒效应的表现取决于自毒物质的累积程度。植物凋落物、残枝和根系分泌物是自毒物质的产生源，而土壤则是自毒物质累积的媒介和库[27]。轮作禾本科作物能消减自毒作用，改善土壤理化性状，对土壤有一定的修复作用，为后茬同种植物提供良好的生长环境[28]。从本研究结果看，不同浓度土壤浸提液对紫花苜蓿种子萌发、幼苗生长的影响存在显著差异，不同轮作模式的同浓度土壤浸提液处理也存在显著差异。与CK相比，5年苜蓿轮作玉米、小麦后的土壤浸提液显著促进了苜蓿种子的萌发(P<0.05)、幼苗胚根和胚芽的生长，且轮作2年小麦的促进效果最佳。土壤浸提液对苜蓿种子发芽率、幼苗胚根长和胚芽长的影响，160 g·L-1显著高于10和50 g·L-1(P<0.05)处理，表明轮作玉米、小麦的土壤浸提液浓度越大，促进作用越强。

草田生产中，轮作作物前后茬搭配与自毒作用密切相关。一般来说依据前后茬作物的种间化感作用和亲缘关系选择轮作作物种类时，通常亲缘关系越远、生境差异越大，轮作效果越好，而适宜轮作搭配的作物种类都是化感相生的植物[29]。植物自毒作用的机理很复杂，目前许多研究表明，植物自毒作用通过增强或减弱细胞器膜的透性，使细胞生理活动或物质运输发生改变，进而引起细胞分裂、光合作用、蛋白质和叶绿素合成等一系列生理代谢过程发生变化[30-31]。可溶性糖参与调节植物体内的渗透势，从而维持植物蛋白质稳定性[32]。MDA是具有细胞毒性的物质，其含量常用来衡量植物受到伤害的严重程度[33]。SOD、POD、CAT和APX是植物体内常见的抗氧化保护酶，其含量及活性强弱反映了机体内氧自由基及歧化反应H2O2的清除能力[34]。本研究发现，随着轮作土壤浸提液浓度的提高，苜蓿幼苗的SS含量显著提高及SOD活性显著增强(P<0.05)，轮作玉米的土壤浸提液使苜蓿幼苗中MDA含量快速提高、CAT活性增强，而轮作小麦的土壤浸提液使苜蓿幼苗中MDA含量呈先降后升的变化趋势、CAT活性显著减弱(P<0.05)，轮作2年玉米、2年小麦后苜蓿幼苗的APX、GPX活性显著增强，表明轮作处理对苜蓿幼苗化感作用的影响很可能与引起这些生理物质含量升降、酶活性强弱变化有关，可能也是其对逆境调节反应的一种生存机制。

本研究结果可为阐明苜蓿与禾本科作物间的化感效应利用提供一定的参考，同时也为利用轮作提高苜蓿和作物轮作系统产量提供理论依据。然而，要完整地评价前、后茬种间的化感效应，还需以全生长周期的受体为对象进行深入研究。

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