褪黑素对糖尿病肾病大鼠肾脏的影响

刘昌明，邓良超，孙玉锦

糖尿病肾病(diatetes nephritic，DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是慢性肾功能衰竭的的主要病因。随着糖尿病发病率不断上升，DN的发病也逐年增加。褪黑素(melatonin，Mel)化学名是N-乙酰-5-甲氧基色胺，是松果体分泌的一种吲哚类激素，全身各组织器官内均有Mel存在，在调节睡眠，抵抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、保护神经细胞看、抗氧化、抗凋亡、调节血糖等方面具有广泛的生理和药理作用[1-2]。

本研究采用大鼠DN模型，探讨褪黑素对大鼠DN肾脏影响极其机制，为褪黑素对DN防治提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 链脲佐菌素、褪黑素购自Sigma公司；肌酐(Cr)测试盒，血尿素氮(BUN)测试盒，尿蛋白测试盒(定量测试盒)，超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物公司；细胞凋亡检测试剂盒(POD)DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、彩色预染蛋白质Marker、BeyoECL Plus、显影定影试剂盒、HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)均来自碧云天生物技术研究所，兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体epitomics公司，PVDF膜购自Roche公司，琼脂糖来自西班牙，脱脂奶粉超市购买。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的复制 体重160±10g的SPF级健康雄性SD大鼠24只，适应性喂养3天后，禁食不禁水12h，随机分为正常对照(NC)组、糖尿病肾病组(DN)，褪黑素(Mel)组各8只，DN组、(Mel)组给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg(STZ溶解于pH4.4，0.1mol/L的柠檬酸缓冲液中)，NC组注射相同体积柠檬酸缓冲液。禁食不禁水6 h后。DN组、Mel组每天分别给予褪黑素20mg/kg/d灌胃(Mel溶于无水乙醇中，再生理盐水稀释，使之成为含有2%乙醇的生理盐水溶液)和给予高脂饲料，NC组给予等量含有2%乙醇的生理盐水溶液灌胃、给予普通饲料。连续给药6周。

1.2.2 实验标本采集6周后各组大鼠禁食不禁水12小时，收集24小时尿液,断尾取血，用血糖仪检测FBG。3%戊巴比妥钠2mL/kg麻醉心脏穿刺取血备用，取双肾，一侧肾脏部分用4%中性甲醛固定，制作石蜡切片，用于观察肾脏的组织结构，另一部分制备1%的组织匀浆检测肾组织氧化应激水平，另一侧肾脏放于-80℃冻存备用。

1.2.3 石蜡切片的处理石蜡切片常规HE染色；Masson染色：切片脱蜡至水，Masson复合液染色5min，依次用0.2%醋酸、5%磷钨酸、0.2%醋酸、2%苯胺蓝、0.2%醋酸、无水乙醇冲洗，脱水，透明树胶封片；TUNEL染色：采用原位末端标记法，按照试剂盒说明说进行检测细胞凋亡情况，计算凋亡指数(AI)。

1.2.4 肾脏氧化应激水平的检测取肾组织匀浆按照试剂盒说明书检测肾组织内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。

1.2.5 肾功能的检测按照试剂盒说明书Fearon法检测BUN；Jaffe除蛋白法检测Scr；采用CBB法检测24hUP。

1.2.6 Western blot法检测肾组织Caspase-3蛋白测定采用Western blot法。肾组织经过匀浆—裂解—离心—蛋白定量—充分变性，-40℃保存。

按SDS-PAGE凝胶配置试剂盒说明书配制出12%分离胶，灌注到两块玻璃板的间隙中，注入ddH2O液封。在分离胶完全聚合后，倾倒出ddH2O，配制5%的浓缩胶摇匀静置直接灌满，并立即插入梳子。将凝胶玻璃板固定于电泳槽内，向槽内加入电泳缓冲液。然后加样、用100V恒压电泳约30min、剪出与胶大小一致的PVDF膜，用甲醇湿润，和胶、转膜滤纸、海绵一起放入转膜缓冲液中转膜，390mA恒流转膜50min。将转膜后PVDF膜TBS漂洗，用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜，进过孵一抗(caspase-3一抗)、孵内参(Rabbit anti-β-actin)、孵二抗(HRP标记山羊抗兔IgG)、ECL化学发光、压片、显影、定影。结果用Quantity one软件分析各组蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，各组数据采用均数标准差(±s)表示。各组间采用成组设计的两样本均数比较的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般状况与血糖的改变 NC组，体重增加，精神好，反应灵敏，毛发鲜艳有光泽；DN组精神萎靡，反应迟钝，皮毛无光泽，多饮、多食、多尿症状明显，与NC组相比FBG较显著升高；Mel组大鼠精神稍好，毛发有光泽，反应较灵敏，与DN组相比FBG较下降不明显(见表2)。

2.2 病理学改变HE染色显示NC组大鼠肾小球和肾小管无明显病理改变；Masson染色肾脏未见明显纤维组织增生(图1)；TUNEL染色细胞凋亡少或无(图4)；DN组HE染色可见变肾小管扩张、上皮细胞水肿，内皮细胞和系膜细胞增生显著；Masson染色见基底膜增厚，系膜增宽，肾小球纤维化，部分肾小管萎缩甚至消失，间质纤维组织增生(图2)；TUNEL染色凋亡细胞较DN组和Mel组明显增多(图5)。Mel组与DN组相比肾小管水肿较明显减轻，纤维化有明显的改善，凋亡细胞也明显减少(图3、6)。

图1 NC组肾组织结构

图2 DN组肾组织结构

图3 Mel组肾组织结构

图4 NC组肾组织结构

图5 DN组肾组织结构

图6 Mel组肾组织结构

图7 各组织caspase-3的表达(相对灰度)

2.3 血糖、肾功能的变化 与NC组相比：DN组Scr 、BUN、24hUP明显升高(P<0.05)。与DN组相比：Mel组Scr 、BUN、24hUP均明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组FBG、BUN、Scr 、24h尿蛋白(UP)的变化(±s)n=8

2.4肾组织氧化指标变化 与NC组相比：DN组肾组织中SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。与DN组相比：Mel组肾组织SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05)，MDA含量明显下降(P<0.05)。见表2。

表2 各组肾组织SOD、GSH-Px、MDA的变化(±s)n=8

2.5Caspase-3蛋白和AI的变化 与DN组相比,Mel组肾脏细胞AI明显降低(P<0.05)caspase-3蛋白的表达表达量均显著升高(P<0.05)；与NC组相比：DN组肾脏细胞AI、caspase-3蛋白的表达量均明显降低(P<0.05)(图7)

表3 各组AI、caspase-3蛋白的变化(±s)n=8

3 讨 论

本实验采用一次性腹腔内注射STZ30mg/kg加高脂饮食复制大鼠DN模型，实验6周后，DN组大鼠出现了肾小管扩张、上皮细胞水肿，内皮细胞和系膜细胞增生，基底膜增厚，系膜增宽，肾小球纤维化，部分肾小管萎缩甚至消失，间质纤维组织增生等明显的肾组织结构损害，说明DN模型复制成功[1～2]。

DN是糖尿病常见的微血管并发症，也是导致终末期肾功能衰竭的重要的原因。近年来对DN发病机制的研究中，氧化应激和细胞凋亡成为研究其发病机制的重要的环节。动物实验表明[3]，使用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在实验第8周时已经出现氧化应激水平升高和肾功能损害，因此血糖升高可能是DN发生的关键因素。在糖尿病肾病患者存在明显的氧化应激反应[4-5]。持续的高血糖可导致SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性降低，使肾脏的抗氧化能力下降，MDA可以反应机体的过氧化强度，其含量升高使机体氧化应激水平增强，机体产生大量的活性氧(ROS),ROS的大量增加，加重了肾脏的负担，促进机体的氧化应激反应[6]。由于大量ROS的产生，使细胞膜发生脂质过氧化反应，可导致微血管内皮细胞损伤使肾小球滤过膜电荷屏障和孔径发生改变，肾小球滤过率增加，引起蛋白尿的发生[7]。ROS可使肾小球毛细血管基底膜发生脂质过氧化，使其增厚；通过MAPK途径诱导肾小管上皮细胞转分化，参与肾间质纤维化形成。氧化应激水平的增强，可使增强的单核细胞对血管内皮的黏附和浸润，使肾小球系膜细胞增生、增加了血管内皮细胞通透性[8]。长期的高血糖还可以增强机体蛋白糖基化反应，降低机体的抗氧化能力，使肾组织产生大量的MDA，过多的MDA与含有游离氨基酸的蛋白质发生交联反应，导致血管基底膜增厚，使肾组织血管壁通透性增加，加重肾脏的损伤，导致肾小球高滤过和大量蛋白尿[9-10]。

徐益笑等[11]通过对稳定高血糖大鼠的研究发现，高血糖可使肾组织内促凋亡基因Bax蛋白表达增多，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达减少，肾小管上皮细胞凋亡细胞明显增多，认为高糖状态可能改变了凋亡调节基因的表达，进而诱导肾小管上皮细胞凋亡，抑制细胞增殖导致肾功能受损。在大鼠糖尿病模型建立4周后就可出现肾脏明显的细胞凋亡[12],表明在DN早期肾组织就出现了细胞凋亡，因此在持续的高血糖作用下，肾组织细胞凋亡增多，增殖细胞减少，从而导致肾功能障碍的发生。caspase家族在细胞凋亡的发生过程中具有重要作用，其中caspase-3蛋白使细胞凋亡的主要执行者。此外，ROS的增多也与细胞凋亡有着密切关系，增多的ROS作为早期凋亡信号分子，直接激活促凋亡的p38MAPK和caspase-3途径，进而引起细胞凋亡。ROS也可直接损伤DNA诱导细胞凋亡，或者攻击蛋白质使蛋白质的功能丧失，从而诱导细胞凋亡[12]。

本实验表明，DN组大鼠FBG和Scr、BUN、24hUP明显升高，肾组织中SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量明显升高，caspase-3蛋白的表达量以及AI显著升高，说明糖尿病大鼠肾组织出现明显的损伤，氧化应激水平增强，细胞凋亡增多。

给予外源性的Mel后，除DN大鼠的血糖具有一定程度降低外，Mel可显著降低大鼠DN时的BUN等指标，具有明显的改善肾功能作用；显著升高SOD活性和降低MDA含量，显著降低caspase-3蛋白的表达量以及AI，SOD作为抗氧化酶，可特异性地清除氧自由基,其水平升高说明机体抗氧化应激能力增强。显示褪黑素可能通过降低肾脏的氧化应激水平，使ROS生成减少；Mel还能激活线粒体复合体，维持呼吸链电子传递，减少线粒体ROS的生成[13-14]。从而降低肾脏血管壁的通透性和脂质过氧化反应，减轻对基底膜的损伤；抑制肾脏细胞的凋亡，从而发挥对肾脏的保护作用。

综上所述，褪黑素能够明显改善DN时的肾功能和减轻肾脏的损伤，抑制肾脏细胞的凋亡，发挥对肾脏的保护作用。其机制可能是通过一定程度的降糖作用，减少肾ROS的产生，降低氧化应激水平，提高抗氧化酶的活性，减少细胞凋亡等实现的。

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