“固相萃取-液相色谱质谱联用法定性分析PFOA”实验课的设计与实践

高珊珊， 石 晗， 齐 虹， 田家宇

(1. 河北工业大学 土木与交通学院， 天津 300401； 2. 哈尔滨工业大学 环境学院， 哈尔滨 150090)

0 引 言

液相色谱质谱(LC-MS)分析法由于具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行等优点，已经逐步成为环境领域中非常重要的分析方法[1-5]。样品的预处理过程是液相色谱质谱分析的一个重要环节，样品处理效果的好坏直接影响后续仪器测试所得数据的准确性。

样品的预处理方法很多，有液液萃取、膜萃取、液相微萃取、固相萃取法等[6-7]。其中，固相萃取法(SPE)由于具有对目标物选择性强、有机溶剂使用量少、分离操作时间短等优点在环境领域应用最为广泛[8-10]。SPE技术的关键是根据目标物的化学性质(如极性、pKa、分子量、浓度等)选择适合的固相萃取柱。目前，实验室中多采用C18柱，C18柱适合于分离非极性到中等极性的化合物。但对于极性较强的阴离子化合物，则可采用弱阴离子型的Wax柱，该固相萃取柱对强酸性阴离子化合物具有高的选择性和灵敏度，适用于合成着色剂和强酸性有机物的预处理，如磺酸盐、全氟酸等。以全氟辛酸(PFOA)为例，PFOA为强极性、强酸性、阴离子化合物，pKa仅为2.5，采用传统C18固相萃取，回收率较低，而采用Wax柱进行固相萃取，则能取得很好的效果。

结合我学院环境学科的特点，本文以液相色谱-质谱技术为核心内容，设立了“固相萃取-液相色谱质谱联用法定性分析全氟辛酸(PFOA)”这一实验课，目的是使学生了解液相色谱质谱仪的基本组成和功能原理；学习和掌握质谱仪器的基本操作和分析方法；掌握利用固相萃取技术对环境样品进行预处理的方法。

1 实验部分

1.1 基本原理

液相色谱-质谱联用技术是指高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)串联的技术，该技术结合了HPLC的高效分离能力和MS的高灵敏度和极强的专属性的分离检测技术，目前已成为有机物分析的重要方法之一。HPLC-MS系统组成如图1所示，HPLC-MS样品分析过程为：待测样品通过进样器进入液相色谱系统，由色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次进入质谱的离子源处被离子化，然后离子被聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号转变为电信号，传送至数据处理系统。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所得的条状图就是常见的质谱图。

图1 HPLC-MS系统组成

本实验所用液质联用仪采用的是电喷雾电离源，该离子源为软电离，即化合物在一级质谱电离过程中不易发生分解，通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，便于进行分子量确认。多级质谱分析则是通过对准分子离子进行多级裂解，获得子离子碎片信息，进而给出该分子离子和准分子离子的结构信息，实现对未知物质的高质量定性分析。

SPE是一种吸附剂萃取技术，利用选择性吸附和选择性洗脱的液相色谱法分离原理，样品通过萃取柱时，目标物和杂质被保留在柱上，然后用选择性溶剂去除杂质，再洗脱出目标物，从而达到目标物分离、净化和浓缩的目的。

PFOA是一类脂肪烃碳链上与碳原子相连的氢原子被氟原子取代的人工合成化合物，具有表面活性强、热稳定性强、耐酸碱、耐强氧化剂等独特的物理化学性质，被广泛应用于生产和生活中。该类物质在自然环境和生物体中被频繁检出，其迁移和转化为环境领域的热点问题[11-14]。实验选取PFOA作为目标物，采用Wax柱对其进行净化和浓缩。该固相萃取过程依靠PFOA与填料层的吸附剂之间的静电引力实现。因此，实验需要调节溶液的pH以改变目标物或者吸附剂的离子化或者质子化程度，PFOA的pKa为2.5，在pH为2～14范围内，PFOA均以阴离子形式存在，而Wax柱的pKa=6，当pH<4时，Wax以正离子形式存在，可以吸附阴离子的PFOA；pH调至>7时，Wax以质子形式存在，与PFOA发生解吸附。

1.2 实验仪器和材料

实验仪器：美国赛默飞液相色谱-质谱联用仪、美国SUPELCO固相萃取装置、精密电子天平、pH计。

实验耗材和试剂：甲醇、乙腈、乙酸和乙酸铵均为色谱级、Wax固相萃取柱(Waters Oasis 6cc，150 mg，30 μm)、18.2 Ω超纯水、0.1 mol/L HCl、氨水(分析纯)。

液相色谱质谱联用仪运行条件：液相分离使用C18色谱柱 (美国Waters公司，XbridgeTM, 2.1×150 mm, 5 μm)，液相操作条件：柱温30 °C；进样量：20 μL；流速0.3 mL/min，流动相乙腈和超纯水(含10 mmol/L乙酸铵)的体积比1∶1。质谱离子源为电喷雾(ESI)离子源，分析器为离子阱。质谱操作条件：电喷雾电压5 300 V；鞘气和辅助气为高纯氮气，流速10 L/min；喷雾室温度370 °C；碰撞气为高纯氦气；离子源为负离子模式(ESI-)；扫描范围50～700 m/z。二级和多级质谱扫描碰撞能量为20%～50%。

1.3 实验内容

1.3.1水样配制

配制浓度为1 μg/L的PFOA水样50 mL，用HCl(0.1 mol/L)调节水样pH=4。

1.3.2样品固相萃取

(1) 固相萃取柱的活化。依次用4.0 mL 0.1%氨水甲醇(甲醇为溶剂)和4.0 mL甲醇对固相萃取柱进行活化，再用4.0 mL超纯水淋洗。

(2) 上样。加入50 mL水样，通过活塞和真空泵控制流速为1滴/s。

(3) 固相萃取柱的清洗。用4.0 mL 25 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH 4～5)对固相萃取柱进行净化以去除其他杂质。

(4) 固相萃取柱的干燥。将固相萃取柱放入离心机中以3 000 r/min的速度运行2 min。

(5) 目标物的洗脱。依次加入4.0 mL甲醇和4.0 mL 0.1%氨水甲醇以洗脱目标物，并收集于10 mL的玻璃离心管中。

1.3.3样品浓缩

将上述所得的洗脱液用氮吹仪浓缩至1 mL以下，再加入甲醇定容至1 mL。所得的溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行液相色谱-质谱联用分析。

1.3.4样品液质分析

(1) 更换所需流动相，并运行在线脱气程序。

(2) 建立液相色谱分析方法，包括设置流动相比例、流速、柱温等(详见1.2)。

(3) 建立质谱分析方法，包括电喷雾电压、喷雾室温度、扫描模式、扫描范围以及多级质谱碰撞能量的设定等(详见1.2)。

(4) 放入待测试样，运行色谱和质谱程序。

1.3.5数据分析

通过上述实验操作，即可获得质谱图，在液相色谱-质谱联用仪的使用中，质谱图的解析至关重要。

首先对PFOA水样进行一级质谱分析，如图2所示(横坐标为质荷比m/z，纵坐标为相对丰度)，得到了m/z=412.68的分子离子峰，该物质即为PFOA分子的质谱谱图，其结构式见图2。

图2 PFOA的一级质谱图和结构示意图

该仪器的多级质谱过程是母离子与碰撞池中的碰撞气体相撞而产生离子碎片，碰撞能量以百分比(%)表示，该值越高，则碰撞能量越强，母离子裂解生成的离子碎片在数量和种类也相应发生变化。图3所示为PFOA的二级质谱图。以m/z=412.68为母离子，在轰击能量为25%时，可得到母离子m/z=412.65和离子碎片m/z=368.86的峰。后者是由于前者发生碳碳健断裂而形成的，其断裂位置见图3。让学生自己尝试优化碰撞能量值，以使主离子碎片的丰度响应值最高。当设置碰撞能量为30%时(图3(b))，仅得到离子碎片m/z=368.85的子离子碎片峰。说明碰撞能量增大导致母离子全部发生碎裂。因此，在本实验中PFOA二级质谱扫描的碰撞能量30%优于25%。

(a) 碰撞能量为25%

(b) 碰撞能量为30%

图3 PFOA的二级质谱图和离子碎片生成示意图

为激发学生兴趣，可鼓励学生进一步做三级质谱分析，得到的质谱图见图4。得到m/z=368.61，218.92，168.84的碎片离子峰，金航标等[15]在PFOA多级质谱中也得到了类似的子离子碎片。根据获得的离子碎片的质荷比，推测m/z=218.92和168.84分别是368.61在碳三和碳四处发生碳碳键断裂所形成，碎裂机理如图4所示。

21.4固相萃取过程中的注意事项

(1) 固相萃取柱按照柱容量分为不同的规格，有100 mg/1 mL、200 mg/3 mL和500 mg/6 mL等，要求目标物的质量不超过柱内填料量的5%。

(2) 活化过程中不能让填料层暴露在空气中，因为气体会在固定相和水样之间形成气膜，阻碍水样中的目标物向固定相的分配，降低目标物回收率。

图4 PFOA的三级质谱图和离子碎片生成示意图

(3) 上样的流速不能过快，否则会影响目标化合物在固定相的保留。

2 结 语

实验教学是环境专业研究生培养的重要环节。“固相萃取-液相色谱质谱联用法定性分析PFOA”实验课共6学时，3学时进行实验原理讲解和固相萃取实验，获取目标洗脱物后将样品放入氮吹仪进行样品浓缩。3学时进行液质联用仪的讲解和操作，实验结果由学生在课后进行分析。该实验涉及到样品预处理技术、现代色谱学和质谱学，具有知识点多、综合性强的特点，可全面提升学生的科研能力和实验操作能力。到目前，该实验课已开设5年，受到学生广泛好评，实验效果比较理想。

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