西葫芦细菌性茎基软腐病病原的分离与鉴定

董海龙，王建明(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

2012-2016年，作者在山西省晋中市榆次区、太谷县、大同市灵丘县、运城市芮城县等地调查发现温室蔬菜西葫芦瓜根茎基部产生一种病害，症状与中国胡秀芳等报道的半夏细菌性软腐病[1]和中国高必达等报道的朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病[2]、马来西亚E. Nazerian et al.报道的卷心菜软腐病[3]、韩国OKHEE CHOI et al.报道的辣椒根茎软腐病[4]、韩国Jeong Ho Kim et al.报道的仙人掌软腐病[5]、伊朗ESMAEIL MAHMOUD报道花贝母软腐病[6]相似。该病害与李林在山东省12个县区报道的西葫芦软腐病病症相似[7]，可导致温室西葫芦茎基部腐烂，整株枯萎死亡，尤其在重茬3年以上的温室内，发病率为40%～60%，严重影响温室西葫芦种植。本研究利用形态鉴定结合分子生物学技术，明确该病病原，以便为生产提供防治依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病情调察

2012-2013年，温室蔬菜西葫芦生长季节，在山西省晋中市榆次区、太谷县等茎基部腐烂的发生严重的地块进行病情调查，并定期系统观察此病害的发生危害情况，详细记载每个时期症状及发病率。

1.2 病原的分离及纯化

自榆次区上戈村、太谷县郝村温室内采集罹病植株，病原菌分离与纯化参照方中达植病研究法方法进行[8]。将经过表面消毒病组织研碎后移植到灭菌培养皿中，利用NA培养基适温培养病组织。

1.3 病原菌的致病性测定与重新分离

1.3.1 沾根浸泡法

选取长度为15～20 cm，具有4片针叶的健康无病西葫芦苗，移栽营养钵之前，在稀释的106CFU·mL-1的菌液中沾根浸泡1 min，后移栽直径为10 cm的营养钵中，浇水保湿恒温培养，对照组分别在无菌液的NA液体培养基中沾根浸泡1 min，恒温保湿培养[9]。

1.3.2 针刺法

将细菌配置成106CFU·mL-1悬浮液，加入几滴吐温20，选取长度为15～20 cm，具有4片针叶的健康西葫芦苗，用针注入茎基部，保湿培养[9]。

取明显发病的植株，按照1.2的方法重新分离病原菌。

1.4 西葫芦茎基软腐病的病原形态鉴定

通过柯赫氏法则确定具有致病性的细菌进行形态学鉴定。

1.5 生理生化反应鉴定

按照伯杰细菌鉴定手册的方法鉴定[10]。

1.6 病原菌的16srDNA片段的扩增和序列分析

1.6.1 致病菌DNA提取

参考E. Mahmoudi.方法[6]

1.6.2 16S rDNA片段的扩增

参考E. Mahmoudi.方法[6]

1.6.3 PCR产物的克隆测序

PCR扩增产采用双向测序，拼接序列，与GenBank中对应数据库进行相似性比对，将CY39序列与其相似序列用mega4软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 危害症状

温室调查发现，发病主要开始于西葫芦茎基部，后期整株开始萎蔫，叶片和果实未有病斑(图1 A)；茎基部开始出现软腐症状，并伴有恶臭味(图1B)；后期主侧根软腐(图1C)；西葫芦茎基部主茎部位变褐腐烂，早期软腐，后期干燥变酥(图1D)。

图1 西葫芦根茎软腐的田间症状Fig.1 The field symptoms of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot

田间发病情况见表1和表2。从表中可以看出，该病为始于2月，苗期不发病。造成田间产量损失19.4%～45.6%。

表1 西葫芦根茎软腐病的田间发病率/%Table 1 The field morbidity of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot

2.2 病原菌的分离及致病性测定

从山西省温室采集到的西葫芦发病植株中分离纯化一株优势明显的菌株，分别命名为CY39，分别对西葫芦采用沾根浸泡法和针刺法回接CY39，同时设置空白培养液作对照。结果表明，沾根接种3 d后，接种CY39菌株的西葫芦出现萎蔫症状(图2B)；对照组未出现此症状(图2A)；茎基部软腐变褐(图2C左)；图C右对照茎基部未见褐变。

表2 山西省西葫芦根茎软腐病在6月的发病情况调查Table 2 Investigation on the incidence of Cucurbita pepo L. root and stem soft-rot in Shanxi province in June

图2 接种CY39后西葫芦表现的症状Fig.2 Symptoms produced on Cucurbita pepo L. by inoculation of CY39

按照方法1.2重新分离发病的西葫芦上病原菌，结果西葫芦上分离到病原菌与CY39培养形态完全一致。可见CY39是引起西葫芦茎基软腐病的致病菌。

2.3 菌体形态及培养特征

菌落形态观察表明CY39在NA培养基上菌落成灰白色圆形，凸起，半透明状，有光泽。革兰氏染色呈阴性。电镜显微观察，菌体短杆状，两端钝圆，具鞭毛(图3)。

图3 在扫描电镜下的形态和鞭毛特征Fig.3 Bacterial cell shape and flagella of CY39 after flagellum staining(20 000×)

2.4 菌体生理生化特征

与胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovora)生理生化特征比较，CY39与胡萝卜软腐果胶杆菌其相似程度最大(表3)。

2.5 CY39的16S rDNA序列测定分析结果

由于CY39形态和生理生化特征上表现出与胡萝卜软腐果胶杆菌高度相似性，本研究选用CY39进行分子生物学鉴定。

用引物对(27FG09上游引物)5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；(1 540 r下游引物)5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'做双向PCR扩增其16SrDNA，电泳结果如图4所示， DNA片段回收测序后全长1 462 bp。

采用MEGA4软件以16S rDNA相似序列构建的系统发育树见图5。从图5中可以看出，与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上相似序列经BLAST比对的结果表明，该菌株与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)AB680280报告的序列相似度为100%。

表3 CY39和果胶杆菌属的形态和生理生化特征比较Table 3 Comparison of physiological and biochemical characteristics CY39 with Pectobacterium carotovora

注：+：阳性反应 -：阴性反应

Note：+：Positive reaction； -：Negative reaction

图4 CY39的16SrDNAPCR电泳产物Fig.4 EIectrOohresis of PCR product of 16S rDNA of CY39

3 讨论

据调查，山西2007年设施蔬菜种植面积达10 hm2，西葫芦温室栽培面积大，重茬现象非常严重，导致西葫芦细菌性茎腐烂病的发生呈上升局势，对设施西葫芦生产造成严重影响。因此，今后对该病害做系统性研究具有重要的理论和实践意义。

西葫芦属葫芦科植物，其在设施蔬菜高效栽培中面积逐年扩大，有关西葫芦根腐病、茎基腐病的报道主要是镰孢属、疫霉属真菌引起[11]。椐报道胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovarasubsp.carotovora)引起西葫芦茎基部软腐[7]，症状特点与本文中报道的特点相似，按照最新的植物病原细菌分类，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种已归属胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum)[12]。本文报道的茎基部、主根、侧根受害后腐烂，并伴有恶臭味，湿度大时有菌浓产生，茎基部往上逐渐软腐。

查阅近十年来国内外报道，胡萝卜软腐果胶杆菌主要引起卷心菜[3]、辣椒[4]、仙人掌[5]、西葫芦等软腐病[7]。有关该病害的地理分布和发病规律等是今后研究的一个重点课题。

Indira del C.M. Alvarado et al.通过对伯南布哥州的24个土壤样本分析发现，田间调查发现，胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种数量与土壤结构、芽孢杆菌数量有显著的相关性[13]。Grace Kwan et al.通过研究发现，沙门氏菌酸化胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种微需氧环境，抑制细菌的生长，比值是O157：H7[14]。可以为此病害的防治提供新思路。Adilce I. H. Benelli et al.分别通过对四个马铃薯品种接种胡萝卜果胶杆菌，结果表明不同抗病品种对软腐病菌有不同的表现[15]。Young-Jin Koh et al.通过转入BL1基因进入芜青中抵抗胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种，显著提高了芜青的抗病性[16]。有关西葫芦茎基软腐病的防治和抗病性表现有待做进一步深入的研究。

4 结论

利用形态学观察结合生理生化特性测定及分子生物学分析方法，鉴定了危害温室蔬菜西葫芦根茎部的一种病原细菌，即胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种。它可导致西葫芦茎基部软腐。发病规律调查中发现该菌致病性强，条件适宜时潜育期短，发病快，且春季危害较重。因此，今后因加强该病害系统性研究。

图5 基于16SrDNA区碱基序列构建的CY39系统发育树Fig.5 CY39 phylogenetic tree based on 16SrDNA region sequences

参 考 文 献

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