一株百合枯萎病菌的鉴定及其生物学特性研究

翟雅鑫，姚晨阳，薛丽芳，曹挥，李新凤，杜方，郝晓娟*(.山西农业大学 农学院，山西 太谷 03080；.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 03080)

近年来，花卉产业成为了中国的新兴产业。2013年，国家林业局发布了《全国花卉产业发展规划 (2010-2020年)》，明确了花卉产业对促进农民增收致富，培育新的经济增长点的重要意义[1]。山西省花卉产业经过近年来的发展，生产基地已遍布全省各地，切花花卉成为了山西花卉五大类产品系列之一，其中百合鲜切花的市场需求量以每年20%以上的速度增长，发展空间巨大[2]。

百合枯萎病是百合的主要病害之一，防治困难，目前已成为百合花卉产业发展的主要限制因素。该病发病率一般为5%～30%，个别地区可达40%～50%，百合大面积栽培地和连作田块的发病率更是高达70%以上，严重影响百合的经济价值[3～8]。

百合枯萎病是由镰刀菌(Fusarium)侵染引起的一种土传真菌病害。不同地区、不同品种百合枯萎病病原菌存在差异。李诚等报道甘肃地区百合枯萎病病原菌包括尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)和茄腐皮镰刀菌(F.solani)[9]。Li等从宁夏地区观赏百合品种(Sorbonne)枯死植株中分离出了三线镰孢菌(F．tricinctum)[10]。江西地区龙牙百合枯萎病由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮镰刀菌(F.solani)复合侵染引起[11～13]。在对国外百合品种的枯萎病研究中，福建出入境检验检疫局曾截获带有枯萎病菌的日本百合种球，分离鉴定证明该菌为层出镰刀菌(F.proliferatum)[14]。Ana通过进行病原菌鉴定发现西班牙百合枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和层出镰刀菌(F.proliferatum)[15]。Löffler等提出荷兰百合枯萎病的主要病原菌为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)[16]。百合枯萎病病原菌种类繁多，不同种镰刀菌致病性的差异致使该病害的防治更加困难[5]。

病原菌种类及其生物学特性的明确是研究病害流行规律和进行病害防治的基础工作。因此，本文对山西太谷地区百合枯萎病病原菌及其生物学特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 病株采集及病原菌的分离纯化

从山西省太谷县山西农业大学园艺学院百合试验田采集百合枯萎病病株，百合品种为Matrix，属于亚洲百合杂种系。采用组织分离法分离病原菌[17]，获得的菌株于4 ℃保存备用。

1.2 致病性测定

亚洲百合Matrix种球经次氯酸钠消毒、无菌水冲洗后，在106个· mL-1孢子悬浮液中浸泡10 min，定植，在25 ℃条件下培养。以浸泡无菌水为对照，每处理设3次重复。观察记录发病状况并进行病原菌再分离。

1.3 形态学鉴定

形态鉴定参照Lesile的方法进行[18]，将分离物接种于PDA 培养基，在25 ℃条件下黑暗培养。观察其培养性状，并在光学显微镜下观察分离物的形态特征。

1.4 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析

CTAB法提取病原菌DNA[19]。采用通用引物ITSl (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) 扩增病原菌ITS片段。PCR扩增体系：10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol·L-1Mg2+1.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、DNA模板1 μL、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL、ITSl /ITS4各1 μL，dd H2O 13.2 μL。扩增反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸l min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到530 bp左右的扩增片段。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果经BLAST序列比对和同源性分析。以Colletotrichumgloeosporioides(登录号DQ084495)为外群，利用MEGA 6.0软件构建序列的近邻归群(neighbor-Joining，NJ)系统发育树。

1.5 生物学特性研究

1.5.1 温度对菌丝生长及产孢量的影响

用直径5 mm的灭菌打孔器在培养5 d的百合枯萎病菌菌落边缘打取菌饼，将其转接至新的PDA平板上，分别放置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒温条件下黑暗培养，每处理设3次重复。7 d时采用十字交叉法测量菌落直径，8 d时测定该菌的产孢量。产孢量测定：于平皿中加入10 mL无菌水洗脱菌落表面的孢子，使用血球计数板测定孢悬液浓度[20]。新复极差法处理试验数据。

1.5.2 pH对菌落生长及产孢量的影响

配制pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 的PDA培养基，将百合枯萎病菌菌饼(d=5 mm)分别接至不同pH值的PDA平板中，25 ℃恒温条件培养。每处理设3次重复。数据采集及处理方法同1.5.1。

1.5.3 不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

参考李敏等[21]的方法，以查彼克(Czapek)固体培养基作为基础培养基，分别以含等质量碳素的葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、半乳糖作为碳源。以含等质量氮素的蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、尿素、硝酸钠、甘氨酸、硝酸铵作为氮源，配制成含不同碳源、氮源的培养基。将枯萎病菌菌饼(d=5 mm)分别接至含有不同碳源、氮源的平板中，以不添加碳源、氮源作为对照，25 ℃恒温黑暗培养，每处理设3次重复，数据采集及处理方法同1.5.1。

2 结果与分析

2.1 病害症状

百合枯萎病主要危害百合的肉质根和鳞茎盘基部，病原菌侵染后，受害部位变褐腐烂，向上扩展导致鳞茎出现不规则的褐色病斑(图1 A)，后期鳞片从盘基部散开并易剥落。茎基部同样出现黄褐色病斑，潮湿环境下产生白色霉层。地上部症状表现为叶片发黄萎蔫(图1B)。病害发生后期，整株枯死。

2.2 分离与纯化结果

从发病百合鳞茎组织分离纯化获得2种形态不同的镰刀菌，分别选择代表菌株SXLWF11、SXLWF23进行致病性测定。

2.3 致病性测定结果

接种SXLWF23的百合植株，3 d后叶尖开始发黄，之后叶片逐渐萎蔫。鳞茎出现褐色病斑，鳞片从盘基散开，无菌水对照不发病(图1C)。从发病植株上再次分离获得菌株与接种菌株一致。接种SXLWF11的百合植株不发病。试验结果表明SXLWF23是百合枯萎病的病原菌。

2.4 形态学鉴定

在PDA培养基上SXLWF23菌落圆形，气生菌丝白色(图2 A)，背面产生粉紫色色素(图2B)。瓶梗式产孢，小型分生孢子椭圆形或棍棒形，无分隔，大小4.5～11.0 μm × 2.1～5.8 μm，常聚生于分生孢子梗顶端，呈假头状或串珠状排列(图2C，2D)。大型分生孢子较少，镰刀形，3～5个分隔，大小12.4～39.9 μm × 2.5～5.2 μm(图2D)。

图1 百合枯萎病症状(A. 田间鳞茎发病症状；B. 田间植株发病症状； C. 人工接种病原菌后发病症状，左：无菌水对照，右：接种病原菌.)Fig.1 Symptoms of lily wilt disease( A. Symptom of bulb in the field; B.symptom of plant in the field; C. The symptom of artificial inoculation with pathogen. Left: sterile water CK; Right: pathogen)

图2 病原菌形态特征(A-B. PDA上培养5 d后的菌落形态；C. 产孢梗；D. 分生孢子.)Fig.2 Morphological characteristics of the pathogen( A-B. Colony cultured on PDA in darkness for 5 days；C. Microconidia in situ on PDA；D. Conidia)

2.5 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析

用引物ITSl和ITS4对菌株SXLWF23进行PCR扩增，将序列提交至GenBank，获得的登录号为MG461559。同源性序列分析结果表明，SXLWF23与层出镰刀菌(F.proliferatum)(登录号GQ942905)的相似性为98%。系统发育树显示，SXLWF23与层出镰刀菌(F.proliferatum)聚为一个分支，支持率99%(图3)。结合形态学特征与分子生物学鉴定结果，将SXLWF23鉴定为层出镰刀菌(F.proliferatum)。

图3 rDNA-ITS序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationship tree among SXLWF23 and other Fusarium strains based on the internal transcribed spacer rDNA gene sequences. The tree was generated using MEGA 6.0 software.

2.6 生物学特性研究

2.6.1 温度对菌丝生长及产孢量的影响

不同温度对SXLWF23菌株菌丝生长、和产孢的影响具有一定差异(图4)。病原菌在10～35 ℃范围内均可生长，25～30 ℃生长最快。温度低于5 ℃或高于40 ℃时，菌落停止生长。病原菌在10～35 ℃范围均能产孢，25～30 ℃条件下产孢量最大，显著高于其它温度处理(P<0.05)，5 ℃、40 ℃条件下病原菌不产生分生孢子。

图4 不同培养温度对SXLWF23菌株菌丝生长及产孢量的影响Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

2.6.2 pH对菌丝生长及产孢量的影响

SXLWF23菌株菌丝生长对pH值不敏感，在pH 2～11范围内均可生长(图5)。菌丝生长最适pH为7，7 d时菌落直径可达7.63 cm。总体来看，中性及偏碱性的环境条件比酸性条件更有利于菌丝的生长。病原菌在pH值2～11范围为内均能产孢，最适pH值为6～7。

图5 不同pH对SXLWF23菌株菌丝生长及产孢量的影响Fig.5 Effects of pH value on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

2.6.3 不同碳源、氮源对菌丝生长及产孢量的影响

从表1可以看出，SXLWF23菌株在供试的7种碳源上均可生长，但对各碳源利用程度不同。其中乳糖和蔗糖最利于菌丝生长，而麦芽糖抑制菌丝生长。从产孢量来看，以蔗糖为碳源时，病原菌产孢量最大，而麦芽糖和可溶性淀粉会抑制病原菌产孢。

各供试氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响与不加氮源的对照相比均具有显著促进作用(表1)。7 d时添加不同氮源的菌落直径的大小顺序依次为：蛋白胨>甘氨酸>硝酸钠>尿素>硝酸铵>硫酸铵>氯化铵>无氮源对照。以蛋白胨为氮源时，菌丝生长最快。8 d时添加不同氮源的产孢量的大小顺序依次为：甘氨酸>尿素>蛋白胨>硝酸铵>硫酸铵、硝酸钠>氯化铵>无氮源对照。甘氨酸处理下产孢量最大。在无碳源或者无氮源的条件下，病原菌虽能生长，但菌丝稀疏，需在透光条件下才能看到。

表1 不同碳源、氮源对SXLWF23菌株菌丝生长及产孢量的影响Table 1 Effects of carbon or nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of strain SXLWF23

注:不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，小写字母代表差异显著(P<0.05)。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.01 level and lowercase letters mean significant differences at the 0.05 level in the same column.

3 结论与讨论

层出镰刀菌(F.proliferatum)可侵染多种植物，造成植物根、茎、叶的腐烂萎蔫，引起苗枯、穗腐、根部腐烂等病害，造成严重的经济损失[22]。本试验从百合病株中分离得到层出镰刀菌(F.proliferatum)并通过致病性测定确定该菌为太谷地区百合枯萎病病原菌。

生物学特性研究表明该菌生长和产孢的温度范围为10～35 ℃，最适温度为25～30 ℃。菌丝生长的最适pH为7，产孢最适pH值为6～7。这与王明道、韩冰等报道的层出镰刀菌的生物学特性具有相同的特点[23、24]。本试验中，促进菌丝生长的最佳碳源为蔗糖、乳糖，最佳氮源是蛋白胨。与王明道[23]报道的地黄根腐病病原菌菌株ZJ1生长最适碳源为葡萄糖、蔗糖，最适氮源为硝酸钾、蛋白胨的结论相近。韩冰等[24]对茄子层出镰刀菌花腐病病原菌的生物学特性研究结果表明，菌株Fp01生长最适碳氮源分别为麦芽糖和硫酸铵，这与本试验结论不同，产生这种现象的原因可能是寄主不同导致镰刀菌对碳源、氮源的利用情况不同。促进菌丝生长的最佳氮源是蛋白胨。促进产孢的最佳氮源为甘氨酸。说明该菌在菌丝生长和分生孢子产生过程中对氮源具有不同的偏好。以麦芽糖为碳源时，可以显著抑制菌丝生长和产孢。在实际生产情况中可以使用对病原菌生长和产孢有抑制作用的碳源和氮源作肥料，减缓病害的发生。

参 考 文 献

[1]曹立.2014年中国经济新常态与花卉产业发展[J].中国花卉园艺,2014(23):18-19.

[2]胡海东.东方百合鲜切花在山西北部种植技术研究[J].内蒙古林业调查设计,2010,33(1):125-126.

[3]李琬玥,刘正坪,何祥凤,等.百合枯萎病病原菌的分离鉴定及致病性研究[J].沈阳农业大学学报, 2016, 47(2):153-158.

[4]Rao J, Liu D, Zhang N, et al. Identification of genes differentially expressed in a resistant reaction toFusariumoxysporuminLiliumregale by SSH[J]. Ieri Procedia,2013(5): 95-101.

[5]边小荣.兰州百合枯萎病病原鉴定及病原菌生物学特性研究[D].兰州：甘肃农业大学,2016.

[6]黄娟,付亮,王强,等.百合枯萎病的发生原因及防治措施[J].南方农业,2015,9(15):23-24.

[7]安智慧,黄大野,石延霞,等.百合镰刀菌枯萎病防治药剂的研究[J].中国蔬菜,2010,1(18):23-26.

[8]田丽丽,梁巧兰,徐秉良,等.切花百合枯萎病菌室内药剂筛选及田间防治效果[J].甘肃农业大学学报,2008,43(5):113-116.

[9]李诚,李俊杰.百合枯萎病病原菌鉴定[J].植物病理学报,1996,26(2):192.

[10]Li Y Y, Wang Y J, Xie Z K, et al. First report of lily blight and wilt caused byFusariumtricinctumin China [J]. Plant Disease,2013,97(7):993.

[11]潘其云,朱明德,邓建玲,等.百合镰刀菌枯萎病的发生与防治研究[J].上海农业科技,2004(3):103-104.

[12]邹一平,周蓉,杨士杰,等.镰刀菌与根螨在食用百合鳞茎上的协同侵染及防治[J].江苏农业科学,2006(6):135-138.

[13]梁巧兰,徐秉良,刘艳梅.观赏百合根腐病病原鉴定及药剂筛选[J].甘肃农业大学学报,2004,39(1):25-28.

[14]李敏,宋蕴哲,虞赟,等.进境百合种球中镰刀菌的分离鉴定[J].安徽农业科学,2017,45(4):8-10.

[15]Prados-Ligero A M, Basallote-Ureba M J, Melero-Vara J M. First report ofFusariumoxysporumf. sp.liliiandF.proliferatumaffectingLiliumcrops in Spain[J]. Tropical Plant Pathology,2008,33(3):235-236.

[16]H. J. M. Löffler,Th. P. Straathof, J. R. Mouris,et al. Durability of resistance in lily to basal rot: evaluation of Virulence and aggressiveness among isolates ofF.oxysporumf. sp.lilii[J]. European Journal of Plant Pathology. 1995,101(3):261-271．

[17]方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998：124-125.

[18]Lesile J F, Summerell B A,Leslie JF,et al. TheFusariumLaboratory Manual[M]. Iowa,USA: Blackwell Publishing, 2006：1-388.

[19]杨秀梅,王继华,王丽花,等.百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析[J]. 西南农业学报,2010,23(6):1914-1916.

[20]柳凤,杨顺锦,詹儒林,等.澳洲坚果叶斑病病原鉴定及其生物学特性[J].植物保护学报,2011,38(5):437-442.

[21]李敏,胡美姣,高兆银,等.一种火龙果腐烂病病原菌鉴定及生物学特性研究[J].热带作物学报,2012,33(11):2044-2048.

[22]Strange R N, Gullino M L. The role of plant pathology in food safety and food security[M]. Springer, 2010：3.

[23]王明道,时延光,郜峰,等.1株引起地黄根腐的镰刀菌的鉴定及生物学特性研究[J].河南农业大学学报,2013,47(2):177-181.

[24]韩冰,黄宇飞,张鑫宇,等.茄子层出镰孢菌花腐病病原鉴定及其生物学特性研究[J].沈阳农业大学学报, 2017,48(1):21-26.