正交试验法优选益肾涤浊丸提取工艺△
2018-05-21彭爱娜杨珊田素英
彭爱娜，杨珊，田素英，3*
(1.广东省肇庆市中医院，广东 肇庆 526060；2.广东药科大学，广东 广州 510006；3.广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山 528458)
益肾涤浊丸是广东省肇庆市中医院的制剂，是广东省名中医梁宏正教授多年临床的经验方，由粉萆薢、琥珀、虎杖、泽泻、甘草、黄柏等中药组成，具有益肾补虚、清热解毒、祛瘀散结、通癃涤浊等功能，主要用于治疗前列腺炎等症，临床疗效良好。为保证质量和疗效，本实验以盐酸小檗碱含量和干膏得率为考察指标，采用正交试验设计优选益肾涤浊丸的提取工艺，为进一步开发利用该制剂提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
LC-20AT 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；HT-220A 型柱温箱(天津市恒奥科技发展有限公司)；万分之一电子天平(德国Sartorus公司，CP225D)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200B，150 W)。
1.2 材料
盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201610)；磷酸二氢钾(天津市福晨化学试剂厂，AR，批号：20160607)；甲醇(天津市百世化工有限公司，色谱纯，批号：20160206)；乙腈(天津市百世化工有限公司，色谱纯，批号：20160211)；95%乙醇(天津市百世化工有限公司，AR，批号：20160616)；超纯水(屈臣氏)。
方中所用药材经田素英副教授鉴定均符合2015版《中华人民共和国药典》(一部)标准。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱对照品0.94 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得质量浓度为0.094 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，贮存备用。
2.1.2 供试品溶液 水提溶液：取处方中药材粉末10 g，加10倍量的蒸馏水浸泡1 h，加热回流1.5 h，提取3次，将提取液浓缩得提取物，用甲醇溶解并定容成50 mL，从中精密量取5 mL用甲醇定容成25 mL，充分摇匀后4000 r·min-1离心30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤得样品溶液。
醇提溶液：将水提后所得的药渣烘干后取10 g，加10倍50%的乙醇每次提取2 h，提取3次，将提取液浓缩得提取物，用甲醇溶解并定容成50 mL，从中精密量取5 mL用甲醇定容成25 mL，充分摇匀后4000 r·min-1离心30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤得样品溶液。
2.1.3 阴性对照溶液 取处方减去黄柏的中药材粉末10 g，按2.1.2中水提溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2 数据处理
本正交设计试验结果采用盐酸小檗碱和干膏率进行综合评分[1-2]，计算公式如下：
综合评分=样品小檗碱÷小檗碱最高含量×60%+样品干膏率÷最大干膏率×40%
(1)
干膏率(%)=所提干膏质量÷每份药材的质量×100%
(2)
2.3 色谱条件与系统适用性试验
色谱条件为Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相[3]：乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液(28∶72)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：345 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。可知盐酸小檗碱的保留时间为21.0 min，理论板数不低于5000，分离度大于1.5，且阴性对照在盐酸小檗碱相应保留时间处无干扰。见图1。
注：A.盐酸小檗碱对照品；B.供试品；C.缺黄柏阴性对照品。图1 系统适用性色谱图
2.4 线性关系考察
精密吸取一系列梯度浓度的对照品溶液，于345 nm处测定峰面积，以盐酸小檗碱对照品溶液浓度为横坐标，盐酸小檗碱的峰面积为纵坐标，进行回归分析，得盐酸小檗碱回归方程：Y= 54 489 627.36X+227 374.71，相关系数r= 0.999 7(>0.999 0)。结果表明，盐酸小檗碱在0.009 4～0.094 0 mg·mL-1与峰面积呈良好线性关系。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度考察 精密量取2.1.1对照品溶液6份各20 μL，按2.3项下色谱条件重复进样6次，测定盐酸小檗碱峰面积。RSD=1.40%，表明精密度良好。
2.5.2 重复性考察 精密称取处方中药材粉末10 g，共6份，按2.1.2项下水提溶液制备法制备供试品溶液，连续进样6 次，分别测定盐酸小檗碱含量。结果RSD为2.49%，表明该方法具有较好的重复性。
2.5.3 稳定性考察 精密量取2.1.2的供试品溶液各20 μL，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，按上述色谱条件测定盐酸小檗碱峰面积。结果RSD为2.87%，表明在室温时供试品溶液在10 h内稳定性良好。
2.5.4 加样回收率试验 取已知盐酸小檗碱含量的处方中药材粉末各5 g，共5份，分别准确加入0.662 0 mg对照品，按供试品溶液的制备方法操作，在上述色谱条件下测定，计算加样回收率。平均回收率=100.19%，RSD=0.69%，结果见表1。
表1 盐酸小檗碱加样回收率(n=5)
2.6 优选水提工艺
根据预实验结果分别选取料液比、浸泡时间、提取次数和提取时间4个因素进行正交设计[4-5]。提取液按照2.1.2项下制备，在2.3色谱条件下进行测定，按照标准曲线测定盐酸小檗碱含量；另取提取液10 mL测定干膏率，以盐酸小檗碱含量和干膏率的综合评分为指标，采用L9(34)正交表进行试验，结果见表2～4。
表2 正交试验因素水平表
表3 水提工艺正交试验结果表
表4 水提工艺正交方差分析
由表3分析可知，在水提过程中各因素作用次序为D>C>A>B，即提取次数>提取时间>料液比>浸泡时间。由表4方差分析可知，料液比、浸泡时间、提取时间、提取次数对提取率的影响都无显著性(P>0.05)。由K值可知提取工艺以A2B3C2D3组合为佳，即料液比为1∶10，浸泡时间为60 min，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。
2.7 醇提药渣工艺优选
根据预实验结果分别选取料液比、浸泡时间、提取次数和提取时间4个因素进行正交设计[4-5]。测定方法和考察指标同水提工艺研究，结果见表5～7。
表5 正交试验因素水平表
表6 药渣醇提工艺正交试验结果表
表7 药渣醇提工艺正交方差分析
由表6分析可知，在醇提药渣过程中各因素作用次序为D>A>C>B，即提取次数>乙醇浓度>提取时间>料液比。由表7可知，乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对提取率的影响都无显著性(P>0.05)。提取工艺以A2B3C3D3组合为佳，即乙醇浓度为50%，料液比为1∶10、提取时间为2 h、提取次数为3次。
2.8 验证实验
按照水提工艺研究时所用的测定方法和考察指标，取3批益肾涤浊丸药材，按照水提正交优选的最佳提取条件，按2.1.2方法制备供试品提取液，3个批次益肾涤浊丸水提的盐酸小檗碱的平均质量分数为19.35 mg·g-1，干膏率为24.29%。将水提所得药渣按醇提正交优选的最佳提取条件进行提取，盐酸小檗碱的平均质量分数为16.56 mg·g-1，干膏率为13.84%。
3 讨论
益肾涤浊丸主要用于治疗前列腺炎，黄柏的主要有效成分为盐酸小檗碱，含量高达3%以上，具有抗病原微生物[6]、抗炎、抗菌[7]等作用，可用于治疗前列腺炎[8]，提高免疫能力[9-10]等。因此，选择盐酸小檗碱作为指标成分对提取工艺进行筛选。
益肾涤浊丸由粉萆薢、黄柏、琥珀、虎杖、泽泻、甘草、丹参等16味药材，由于处方药味多，只选取盐酸小檗碱含量作为考察指标不够严谨，另选择干膏率作为实验的指标。
本实验先采用常规的水煎法提取。为了更充分提取有效成分，且盐酸小檗碱在醇类溶剂中有较好的溶解[10]，故将水煎所得药渣进行以乙醇为溶剂的提取，这点在实验结果中也有体现，醇提药渣的9次正交试验中盐酸小檗碱最高的质量分数为16.558 8 mg·g-1，干膏得率也增加了一半，并且由正交试验结果知，所用乙醇浓度为50%，经济成本不高，且有效成分得以充分提取，这正是本实验的创新之处。通过对益肾涤浊丸水提和醇提条件的优化，更好地进行质量标准的制定，使该处方更有效地用于临床。
[1] 郭婷婷，严明明，郝婷婷，等.三黄前必治软胶囊提取工艺[J].中国新药杂志，2008，17(4)：314-317.
[2] 陈程.正交实验法优选黄连中盐酸小檗碱醇提工艺的研究[J].应用化工，2014，43(3)：483-487.
[3] 孙继泽，赵珉，唐岩，等.前列益康胶囊水提取工艺的优选[J].长春中医药大学学报，2015，31(3)：472-474.
[4] 汪文来，赵红霞，白卫国.清宫消炎栓中黄柏提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2006，12(11)：4-5.
[5] 张红梅，程雪梅，王长虹，等.黄连中生物碱提取工艺的正交试验研究[J].中国医药工业杂志，2008，39(8)：588-590.
[6] 武婧，宋忠兴，古川，等.星点设计-响应面法优化黄柏提取工艺研究[J].中国现代中药，2015，17(9)：953-956，969.
[7] 李丹丹，江培，杨书美，等.黄柏的化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J].黑龙江医药，2014，27(3)：601-605.
[8] 贾金铭，薛慈民，张蜀武，等.前列安栓治疗慢性前列腺炎的疗效和安全性[J].中华男科学，2001，7(6)：417-419.
[9] 王秋红，薛娟，曾伟民，等.关黄柏多糖对小鼠免疫功能的影响[G].//第十届全国免疫学学术大会汇编.北京：中国免疫学会，2015，11.
[10] 高文学，刘斌.HPLC测定前列安通胶囊中芍药苷和盐酸小檗碱的含量[J].中国现代中药，2013，15(11)：992-994.
