基于优化显微定量法的吴茱萸质量评价△

刘旭颖，王纹岚，葛朝晖，陈聪慧

(临沂大学 药学院，山东 临沂 276000)

中药质量标准是国家药品标准的重要组成部分。中药成分复杂，品种繁多，现行的质量标准对药品质量控制限于对大部分中药的定性鉴别和少数中药的某一单一化学成分的定量检测，测量和控制中药产品中的任何一种成分无法代表它的整体质量，可控性和专属性尚不完善。以化学药品质量控制方法为模式用于中药产品不够精准、完善。中药的质量控制需要宏观的、多因素的质量控制模式，来适应中药这种基于多成分的协调、互补或制约、起着宏观调控作用的特点。因此，单纯依靠化学分析手段控制中药质量与中药的特点是不相符的，中药质量控制需要多种检测途径的协同应用。

显微定量法是根据显微特征的专属性和稳定性，对中药某一专属特征进行定量分析，从而鉴定中药真伪、优劣的方法。中药显微定量法要求所研究的中药应具有专属性、可计数性的显微特征；所用仪器简单，操作简便。该法可以作为化学方法的补充来检测中药质量。传统显微定量法虽然操作简便，对显微定量法的具体实验设计都没有经过优化，在实践中并没有被推广使用。因此，本研究通过设计优化实验条件，得到优化的显微定量方法，从而对中药进行质量评价。

吴茱萸(Euodiae Fructus)为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实，具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻之功效。本品粉末褐色，非腺毛2～6细胞，长140～350 μm，壁疣明显，有的胞腔内含棕黄色至棕红色物[1-2]。吴茱萸粉末中的非腺毛显微特征明显，不仅具有生物学稳定的特性，而且数量众多，易于观察计数，见图1。本实验采用优化的显微定量方法[3]测定不同样品吴茱萸粉末中非腺毛的显微特征常数值大小；采用高效液相法对吴茱萸中的指标性化学成分柠檬苦素进行含量测定；用统计方法对不同吴茱萸样品中的非腺毛的显微特征常数值与化学成分柠檬苦素含量进行相关性分析，旨在通过测定不同吴茱萸样品中的非腺毛的显微特征常数值大小，判断吴茱萸质量的优劣，为评价吴茱萸的质量提供一种新的方法。通过本课题的研究，为中药的质量鉴定开辟了新的研究方法，为中药质量检测体系进行了有益的充实。

图1 吴茱萸非腺毛

1 仪器与材料

1.1 仪器

OLYMPUS CX-41生物显微镜(日本奥林巴斯公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AUX220万分之一电子分析天平(日本岛津公司)；KQ3200DV超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)；JK-APG-100高速万能粉碎机(上海精学科学仪器有限公司)。

1.2 材料

柠檬苦素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z06M8C30368，纯度>98%)。水合氯醛、甘油、磷酸、乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为分析纯；乙腈、四氢呋喃(天津市康科德科技有限公司)均为色谱纯；实验用水合氯醛试液依照2015年版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)一部附录配制。

吴茱萸样品来源于各大药房及中药材批发市场，由于产地、炮制加工、储存条件等各种因素的不同均会导致质量差异。所有实验样品均经临沂大学药用植物学教研室王文房教授鉴定为吴茱萸正品，具体来源见表1。

表1 吴茱萸样品信息

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2 方法与结果

2.1 吴茱萸各样品水分测定

按《中国药典》2015年版通则0832第二法，测定1～8号样品含水量，结果分别为11.26%、12.53%、13.15%、12.28%、11.82%、13.76%、12.63%、14.57%。

由水分测定结果可知，各样品水分含量均低于15%，符合《中国药典》要求。其中8号样品(来源于临沂中药材批发市场)水分含量接近15%，可能是由于中药材批发市场的贮存条件等影响，水分含量高于其他药店样品。

2.2 显微定量法条件优化设计

针对可能影响显微定量法的实验因素，以均匀设计实验对显微特征常数测定进行实验条件优选，优化显微定量方法。影响因素主要有样品质量、样品的粉碎粒度、混悬剂的用量。考虑到各因素的考察水平有所不同，故本实验采用3因素6水平均匀设计法考察显微定量法的优化条件[4]，吴茱萸中非腺毛显微定量法的均匀设计方案具体见表2。

表2 吴茱萸中非腺毛显微定量法的均匀设计方案U6(63)

取1号吴茱萸样品粉碎，分别过80目和100目筛。精密称定75.0、100.2、125.1、150.1、174.9、200.1 mg共6份，用水合氯醛试液多次水飞，移入25 mL量瓶中，按表2加入相应甘油量，最后用实验用水合氯醛试液定容。充分摇匀后，精密吸取0.02 mL进行显微装片，每份样品溶液平行装片50张，于显微镜下观察非腺毛并计数。将所得的结果随机分为5组，分别计算5组平均值的RSD。以每份样品平均值的RSD为考察指标，实验结果见表3。

表3 吴茱萸中非腺毛数值测定的均匀设计实验结果(n=5)

根据实验设计及结果，通过SPSS 17.0统计软件得出均匀设计结果：Y=13.313-0.021X1-0.057X2，r=0.996；其中Y为RSD(%)；X1为样品质量；X2为粉碎粒度；X3为加入甘油量。从输出的方差分析结果可知，F=186.873，P=0.001，故线性回归模型有统计学意义。

根据均匀设计结果方程：为使实验设计结果Y值(RSD值)最小，选取X1、X2最大值：200 mg、100目为优化条件；X3未进入方程，故根据实验具体情况选择。最终优化结果：样品称样量200 mg，粉碎过100目筛，加入甘油10 mL，Ymin=3.41%，数据精密度良好。

2.3 优化显微定量法的验证实验

取完全过100目筛的1号样品粉末3份各200.0 mg，精密称定，用水合氯醛多次研磨转移至25 mL容量瓶中，加入甘油10 mL，最后用水合氯醛定容，充分摇匀后精密吸取0.02 mL样品液，平行制片50张，于显微镜下观察非腺毛并计数。将所得数据进行完全随机化分为5组，计算每组的RSD值，结果见表4。

表4 吴茱萸中非腺毛数值测定的均匀设计验证实验结果(n=5)

对优化的验证实验结果中，各份样品的变异系数均与优化条件给出的最小变异系数Ymin(3.41%)接近，说明由SPSS 17.0统计软件给出的优化条件是科学、准确的。

2.4 吴茱萸各样品非腺毛显微特征常数值测定

分别精密称定吴茱萸8种样品粉末，每种样品各3份，按照均匀设计实验得到的优化显微定量法条件，水合氯醛多次水飞，分别定容于25 mL量瓶中，精密吸取20 μL溶液，分别平行装片50张，观察非腺毛，计数，按公式(1)计算非腺毛显微特征常数值(P)，取平均值，结果见表5。

P=(X×V)/(V′×m)

(1)

式中：m为样品质量(mg，按干燥品计)；V为定量样品混悬液总体积(mL)；P为定量样品显微特征常数(个·mg-1)；V′为盖玻片下样品混悬液体积(mL)；X为每片盖玻片下样品显微特征数。

表5 各吴茱萸样品中非腺毛显微特征常数值测定结果

2.5 各样品吴茱萸中柠檬苦素含量测定

采用高效液相色谱法对吴茱萸中柠檬苦素进行含量测定[2，5]。

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：[乙腈-四氢呋喃(25∶15)]-0.02% 磷酸溶液(35∶65)；检测波长：215 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃。

2.5.2 对照品溶液的制备 取柠檬苦素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含柠檬苦素0.104 mg的混合溶液，即得。

2.5.3 供试品溶液的制备 取各吴茱萸样品粉末(过三号筛)约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 乙醇25 mL，称定质量，浸泡1 h，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，对照品及1号样品的色谱图见图2。

根据峰面积计算各样品吴茱萸中柠檬苦素含量，结果见表6。

注：A.柠檬苦素对照品；B.1号样品；1.柠檬苦素.图2 吴茱萸样品及对照品HPLC图

表6 各吴茱萸样品中柠檬苦素含量测定

2.6 相关性分析

对吴茱萸各样品中非腺毛的显微特征常数(X)与柠檬苦素质量分数(%)(Y)做线性相关性分析，其结果：Y=0.006X-3.063，r=0.936，F=42.200，P=0.001；P<0.01表示有统计学意义。

结果表明，吴茱萸中柠檬苦素含量与各样品中非腺毛显微特征常数值有相关性(P<0.01)，且呈正相关，即样品中非腺毛显微特征常数值愈大，柠檬苦素含量愈大。

《中国药典》2015年版规定：吴茱萸按干燥品计算，含柠檬苦素(C26H30O8)不得少于0.20%。根据所得到的回归方程可知，含量达到《中国药典》标准的吴茱萸粉末中非腺毛的显微特征常数值应不少于543.83个·mg-1。

3 讨论

根据优化的显微定量法，吴茱萸中柠檬苦素含量与各样品中非腺毛显微特征常数值的相关性有统计学意义，因此，在未提取的前提下，通过测定不同吴茱萸样品中的非腺毛的显微特征常数大小，可以判断药材吴茱萸质量的优劣。根据所得到的回归方程可知，含量达到《中国药典》标准的吴茱萸粉末中非腺毛的显微特征常数值应不少于543.83个·mg-1。因此，可以通过测定吴茱萸粉末中非腺毛的显微特征常数值，即数值大于543.83个·mg-1，即可满足《中国药典》规定的吴茱萸质量。

经过优化的显微定量法，科学、简便，可以作为化学方法的补充来控制中药质量。本研究为中药的质量鉴定开辟了新的研究方法，为中药质量检测体系进行了有益的充实。笔者建议《中国药典》对化学含量及显微特征常数有统计学意义的中药增加显微特征常数值检测方法。

[1] 康廷国.中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2006：351.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：171.

[3] 陈聪慧，康廷国.金银花显微特征常数与化学成分相关性研究[J].中药材，2011，34(9)：1373-1376.

[4] 刘明芝，周仁郁.中医药统计学与软件应用[M].北京：中国中医药出版社，2006：312.

[5] 刘湘丹，蔡嘉洛，邹君华，等.吴茱萸及其炮制品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、和柠檬苦素成分含量对比分析[J].中医药导报，2016，22(3)：39-41.