凤头白鸭凤头性状相关候选基因的表达分析

张 扬，姚文成，王 彬，卢立志，王兆山，徐 琪，常国斌，陈国宏，*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009； 2.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021； 3.江苏益客食品有限公司，江苏 宿迁 223800)

据《事物绀珠》记载，400年前明代饲养有“顶有高毛、白毛、乌骨”的凤头白羽鸭[1]。本课题组经过选育，培育出3 000只具有典型凤头性状的凤头白鸭(暂定名)群体[2]。该群体鸭头部后方的皮肤有一突出的隆起，具有鲜明的观赏特征，可作为动物园、水景湿地公园等观赏品种[3]。虽然凤头性状现已得到一定的利用，但其遗传规律、形成原因以及调控机制尚未阐明。本研究选取了可能与凤头白鸭凤头性状相关的基因作为候选因果基因，对这些基因在2种鸭内脏和皮肤等组织中的表达量进行对比分析，寻找其差异，以期为揭示鸭凤头表型的产生和寻找其致因突变位点提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取10周龄凤头白鸭、连城白鸭各4只，颈部放血后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、背部皮肤、头部皮肤、凤头下皮肤、凤头颅内脂肪体等组织样品，贮存在-70 ℃超低温冰箱备用。

1.2 引物设计

根据NCBI网站GenBank收集的鸭Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2、GAPDH基因序列，利用Primer Blast设计引物，由生工生物工程公司(上海)进行合成。引物序列见表1。

1.3 基因的PCR扩增

采用Trizol研磨法提取2个群体共计8个样品的总RNA，自然干燥后溶于甲酰胺中，-70 ℃保存备用。反转录体系如下：1 μg总RNA样品，1 μL随机引物，4 μL 25 mmol·L-1MgCl2，2 μL 10×RT缓冲液，2 μL dNTP，0.5 μL RNA酶抑制剂，1 μL反转录酶，加入RNase-free H2O至20 μL。反转录程序参照北京天根生物科技有限公司的逆转录试剂盒进行，42 ℃孵育15 min后立即95 ℃孵育5 min，获得的cDNA -20 ℃保存备用。

使用特异性引物，以cDNA为模板，利用PCR进行扩增。各组织候选基因及内参基因重复扩增3次，采用2-△△ct法对数据进行分析。

表1 相关基因扩增引物Table 1 Primers for related genes

2 结果与分析

2.1 Hoxc8基因的组织表达分析

Hoxc8基因在2种鸭心脏(X)、肝脏(G)、脾脏(P)、肺脏(F)、肾脏(S)、大脑(DN)、小脑(XN)、背部皮肤(BP)、头部皮肤(TP)、凤头下皮肤(FP)、颅内脂肪体(ZF)中的表达情况见图1。研究发现，Hoxc8 2种鸭在大脑、小脑和肾脏组织中有少量表达，并且在背部皮肤组织中表达最高，显著高于其他组织(P<0.05)。Hoxc8在凤头白鸭特有组织(凤头下皮肤、颅内脂肪体)中呈现为异常高表达，在连城白鸭头部皮肤(凤头鸭凤头下皮肤对应部位)中表达量极低。

**表示不同品种间差异显著(P<0.01)。**indicated significant difference for that indicator at P<0.01.图1 Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2基因的相对组织表达Fig.1 Relative expression of Hoxc8，EphB2，EphA2，EphA3 genes in tissues

2.2 Eph基因家族的组织表达分析

EphB2、EphA2、EphA3在2种鸭各组织的相对表达见图1。由图可见，EphB2在2种鸭各组织中存在明显的表达差异性。其中，在2种鸭都采集的组织中，大脑和小脑组织中EphB2的表达量最高；同时，EphB2在颅内脂肪体组织(凤头白鸭特有)中，表现为异常的高表达。EphA2在2种鸭的各组织中也均表现为不同程度的表达。其中，在肺、背部皮肤、头部皮肤等组织中表达较高。与EphB2类似，EphA2在颅内脂肪体组织中，表现为异常的高表达。而在相邻的大脑和小脑组织中，EphA2表现出低表达。EphA3在2种鸭的各组织中表现为明显的异位表达规律，其中，EphA3在肺、大脑、小脑等共有的组织中表达较高，在大脑表达最高，显著高于其他组织。EphA3与EphB2、EphA2一样在颅内脂肪体组织中呈现出异常的高表达。

3 讨论

前人通过GWAS分析的方法[4]，将鸡凤头性状决定基因定位在Hox连锁群上，随后Wang等[5]进一步的证实Hoxc8是Hox连锁群上唯一一个和鸡凤头性状直接相关的基因。鸡的Hoxc8基因在各个组织均明显的表现为异位表达，其中肾脏组织和背部皮肤的表达量显著高于其他组织，并且在凤头下皮肤组织中呈中高度表达。本研究发现，Hoxc8基因表现为组织特异性表达，并且在凤头鸭背部皮肤、凤头下皮肤中高表达，验证了将Hoxc8作为凤头性状因果候选基因的可能。早期研究发现，鸭凤头性状的遗传规律不符合孟德尔显性和隐形性状遗传规律，而更可能像受到多基因控制的一个数量性状。在凤头白鸭特有组织颅内脂肪体中，Hoxc8基因的高表达显示，凤头的顶心毛表观性状和颅内脂肪体的发生可能存在一定的连锁性。

Eph作为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族的一个最大的分支，现已知它包含16个成员，其配体命名为Ephrin[6]。根据配体结构及相结合能力，可将Eph受体分成A(10个)、B(6个)亚家族：EphA(EphA1-EphA10)和EphB(EphB1-EphB6)。已有研究表明，在动物神经发育的轴突导向中，Eph发挥了重要作用，并且在组织和细胞之间调控信息的传递。在神经系统之外，如在免疫系统、骨骼、内皮细胞、肿瘤的发展和转移中，Eph和Ephrin也发挥了相关作用[7]，其中在脑肿瘤中，大量研究证实EphA2、EphA3、EphB2、EphB4及其它们相应的配体均表现为高表达[8-9]。

相对于2种鸭的共有组织，在凤头白鸭特有组织颅内脂肪体中，3个候选基因(EphA2、EphA3、EphB2)均表现为较高的相对表达量，与该家族基因在鸽皮肤组织表达较为相似[10]，这说明EphB2、EphA2、EphA3等Eph基因可能与凤头白鸭颅内脂肪的形成有关。这3个基因中，尤其是EphA2在颅内脂肪体的表达量相对于临近的组织大脑、小脑表达量很高，这说明EphA2极有可能和鸽上的机制相似，与鸭凤头性状的形成有密切的联系。90%的凤头白鸭个体的颅内都存在脂肪体，并且有极少数个体表现为运动共济失调，可能由于颅内脂肪体组织的生成使得小脑、嗅球等组织被挤压而体积较小[11]，不能正常生长和发育，对机体的运动产生了影响。

鸭凤头性状如此特殊并且是可遗传的，但其致因突变位点还未被准确定位，本研究分析了与凤头性状形成相关的4个候选基因的组织表达，为寻找鸭凤头性状的形成机制提供了数据参考。

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