古茶树优系品种氨基酸分析

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(1.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.贵州大学园艺专业学科实验室, 贵阳 550025; 3.贵州省茶叶研究所, 贵阳 550025; 4.都匀市科技和知识产权局, 贵州 都匀 558000; 5.遵义市产品质量检验检测院, 贵州 遵义 563000; 6.国家茶及茶制品质量监督检验中心(贵州), 贵州 遵义 563000; 7.贵州大学茶学院, 贵阳 550025)

古茶树是遗传多样性最丰富、最具有保存和研究价值的初级茶树种质资源[1]。古茶树资源中富含的许多特异性状，如高茶多酚、低咖啡碱、高茶氨酸、高抗性基因源、茶黄素形成能力强等可以直接利用[2-4]。古茶树作为茶树育种的物质基础，是繁育新品种的原始材料，是种质资源的重要组成部分，是茶学领域研究的基础[5]。

茶叶中的氨基酸是茶叶品质的重要组成部分[6]，决定茶汤滋味，与茶叶的品质有一定的相关性，同时又是人体所必需的营养物质，对人体疾病的预防和康复起着极为重要的作用。茶叶中氨基酸的组成、含量及其降解产物和转化产物的含量变化将直接影响到茶叶的品质、香气和滋味，因此，测定古茶树中氨基酸的含量和种类对古茶树的开发利用具有重要的意义。

植物中氨基酸的测定方法主要有甲醛滴定法[7]、凯氏定氮法[8]、分光光度法[9]、色谱法(主要有：气相色谱法[10]、液相色谱法[11-12]、毛细管电泳色谱法[13])、电化学法[14]等。高效液相色谱法简便、快速、灵敏，可以对茶叶中氨基酸进行定性和定量测定，是目前较常用的方法[15]。本研究以来自贵州不同地区的4个古茶树优系为材料，研究高效液相色谱法(HPLC)测定古茶树氨基酸的色谱条件，并分析4个古茶树氨基酸组分和含量，以确定一种适用于古茶树氨基酸测定的高效液相色谱法，为合理开发利用古茶树提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

供试材料为贵州大学茶学实验基地的古茶2号、古茶4号、古茶6号及古茶8号的4年生扦插茶树春梢1芽2叶，以种植在茶学实验基地的福鼎大白茶春梢1芽2叶作为对照(详见表1)。

表1 供试材料

编号来源2遵义市正安县4黔南州贵定县6黔西南州兴义市8黔西南州普安县福鼎大白茶(ck)贵阳花溪

主要试剂有氨基酸标准样品(该标准品购买于SK Chemicals)：组氨酸(L-His)、甘氨酸(L-Gly)、茶氨酸(L-Thea)、精氨酸(L-Arg)、半胱氨酸(L-Cys)、丝氨酸(L-Ser)、脯氨酸(L-Pro)、缬氨酸(L-Val)、亮氨酸(L-Leu)、丙氨酸(L-Ala)、苏氨酸(L-Thr)、赖氨酸(L-Lys)、谷氨酸(L-GLu)、天冬氨酸(L-Asp)、苯丙氨酸(L-Phe)、络氨酸(L-Tyr)、甲硫氨酸(L-Met)、异亮氨酸(L-Ile)。

色谱纯：乙腈、苯异硫氰酸酯。

分析纯：无水乙醇、三乙胺、盐酸。

1.2 仪器与设备

主要仪器与设备为滤纸、漏斗、玻璃棒、铁架台、烧杯、容量瓶、微波炉、水浴锅、三角瓶、分光光度计、分析天平、电热恒温水浴锅、高效液相色谱仪、超纯水仪、漩涡混合器、移液枪、手动进样器、烘箱等。

1.3 试验方法

1.3.1 材料处理方法

3月中旬于贵州大学茶学实验基地采摘试验材料，采摘标准为1芽2叶，采摘后的每一个鲜叶材料用随机取样法抽取10个芽头，并把每个材料在250 ℃左右杀青、干燥40 min后于烘箱中103 ℃烘干，密封冷藏保存备用。

1.3.2 测定方法

采用103 ℃恒重法测定水分[14]，游离氨基酸总量采用茚三酮比色法[15]，游离氨基酸的定量定性分析采用高效液相色谱法[16]。

1.3.3 试剂配制

1) 混合氨基酸标准溶液的配制。

准确称取天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、撷氨酸、甲硫氨酸、半肤氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸各0.200 0 g，用0.02 mol/L HCl溶解并定容至500 mL。配制成每种氨基酸含量为0.400 0 mg/mL的混合氨基酸标准溶液，放入4 ℃冰箱保存。

2) 衍生试剂的配制[16]。

用超纯水、三乙胺(TEA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、无水乙醇，按体积比1∶1∶1∶7的比例配制10 mL(使用前临时配制)。

3) pH=6.77硼酸缓冲液的配置。

A液：取硼酸1.236 8 g，氯化钠0.292 5 g混合后加水溶解，并定容至100 mL。

B液：取硼酸钠1.90 7 g，加水溶解并定容至100 mL。

取A液97 mL，B液3 mL混合后即为pH为6.77的硼酸缓冲液。

4) 18种氨基酸标准曲线标液的配制。

准确称取0.015，0.025，0.035，0.045，0.055，0.065 g氨基酸标准样品至50 mL容量瓶，用0.02 mol/L盐酸定容，配置成0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 g/L的氨基酸标样储备液。分别移取10μL氨基酸标样储备液于离心管中，加入20μL衍生液和70μL硼酸缓冲液，涡旋混合10 s，静置1 min后于55 ℃下加热10 min，吸取10μL上机分析。

5) 供试样品溶液配制。

精确称取0.3 g(精确至0.001 g)茶叶试样于50 mL带塞的三角锥形瓶中，加入0.02 mol/L HCl，立即将锥形瓶移入沸水浴中，浸提45 min，每隔10 min摇动锥形瓶1次，浸提完毕后用脱脂棉趁热过滤，滤液转移至50 mL容量瓶中，用少量热蒸馏水将残渣洗涤2～3次，所得滤液一起并入上述50 mL容量瓶中，待滤液冷却后用0.02 mol/L HCl溶解定容、混匀，0.45μm水系微孔滤膜过滤，待衍生化。

表2 不同流动相处理

处理流动相A流动相B检测波长(nm)流速为(mL/min)柱温(℃)进样量(μL)处理1乙腈超纯水2541.04010处理2甲醇超纯水2541.04010处理3乙腈甲醇2541.04010处理4乙腈∶水=1∶3甲醇2541.04010处理50.1mol/L无水醋酸钠∶乙腈=93∶7乙腈∶水=8∶22541.04010

图1 超纯水与0.2 mol/L HCl溶解谷氨酸色谱图

6) 衍生化过程。

分别准确吸取对照品和供试样品溶液各10μL离心管中，加入20μL衍生液和70μL硼酸缓冲液，涡旋混合10 s，静置1 min后于55 ℃下加热10 min，吸取10μL上机分析。

1.4 色谱条件及流动相

1.4.1 色谱系统

高效液相色谱仪：日本岛津公司的LC-20 A HPLC

色谱工作站：日本岛津公司的LC-20 A的色谱工作站

分析色谱柱：日本岛津公司C 18柱。

1.4.2 溶剂的选择

准确称取0.02 g谷氨酸2份，一份用超纯水溶解并定容至50 mL；另一份用0.2 mol/L HCl溶解定容至50 mL，然后以PITC作为衍生试剂进行衍生反应，选择流动相A：0.1 m无水醋酸钠(用冰醋酸调节其pH=6.5)∶乙腈=93∶7；流动相B：乙腈∶超纯水=8∶2；进行梯度洗脱。

1.4.3 流动相的筛选

试验采用0.2 mol/L的盐酸作为溶剂，用谷氨酸作为检测物质，高效液相色谱仪测定古茶树氨基酸含量的条件为检测器检测波长254 nm，色谱柱流速为1.0 mL/min，柱温是40 ℃，以强度和对称性作为选择指标以确定检测氨基酸的适宜流动相。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel软件对数据进行常规整理，运用SPSS软件进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 溶剂的选择

由图1可知，超纯水溶解色谱图的强度为8.5，并且对称性不好；盐酸溶解色谱图的强度为57，且对称性好。根据出峰强度和对称性，选择0.2 mol/L HCl作为氨基酸的溶剂。

2.2 流动相的选择

由图2可知，5个流动相处理下出峰强度最大为流动相处理5，达110，且5个流动相处理下流动相处理5的峰对称性比其他4个处理好，流动相处理5在出峰前没有下凹的迹象，在出峰的整个过程中没有出现双峰。因此，选取最佳的流动相为流动相A:0.1 mol/L无水醋酸钠(pH=6.5)∶乙腈=93∶7，流动相B:乙腈∶水=8∶2。

2.3 18种氨基酸混合标样色谱图分析

从图3可以看出，18种氨基酸混合标样各组分之间的分离良好，分离效果满意。而且各组分的峰型也呈现出良好的对称性。分析周期为60 min，但是在30 min时18种氨基酸已经完全分离出来。从图形上看，该方法能够较好地分离氨基酸组分，色谱图形较好，在保证分离效果的同时，实现了较快分析的目的。

图2 不同流动相对谷氨酸峰值和对称性的影响

图3 18种氨基酸标准样品色谱图

表3 18种氨基酸混合标样出峰顺序及出峰时间表

出峰顺序 氨基酸名称出峰时间(min)1 半胱氨酸3.362 天冬氨酸3.833 谷氨酸4.114 丝氨酸7.495 甘氨酸8.176 组氨酸9.247 精氨酸11.308 丙氨酸11.889 脯氨酸12.7010 茶氨酸17.8011 络氨酸20.2912 缬氨酸21.6113 甲硫氨酸22.5314 苏氨酸24.7015 异亮氨酸25.0516 亮氨酸25.5017 苯丙氨酸27.5018 赖氨酸29.63

2.4 18种氨基酸标准曲线表

由表4可知，相关系数在0.995 8～0.999 9之间，表明线性关系良好，该方法满足氨基酸定量分析的要求。

表4 18种氨基酸标准曲线表

编号 氨基酸 标准曲线方程相关系数R1半胱氨酸y=154095x-27130.99982天冬氨酸y=54060x-16530.99973谷氨酸y=664225x-33020.99924丝氨酸y=208940x-3670.99985甘氨酸y=112424x-11060.99986组氨酸y=372677.5x-6260.99997精氨酸y=174145x-16490.99588丙氨酸y=79502x-13570.99989脯氨酸y=82207x-9350.999710茶氨酸y=46732x-14810.999811酪氨酸y=62005x-16420.999912缬氨酸y=116912.5x-9610.999313甲硫氨酸y=9021.5x-15930.999414苏氨酸y=210917.5x-2720.998615异亮氨酸y=168177.5x-7700.999716亮氨酸y=256710x-6760.999717苯丙氨酸y=113555x-11750.999918赖氨酸y=584532x-16160.9993

注：y为色谱图的峰面积，x为氨基酸浓度。

2.5 4个古茶树春梢游离氨基酸含量分析

由表5可知，各古茶树的游离氨基酸总量均高于ck，4个古茶树氨基酸含量以6号最高，8号古茶树最低。

从茶叶样品中氨基酸的含量上看，不同茶样之间的氨基酸组分含量有一定规律。在所测定的18种氨基酸中，茶氨酸的含量最高；而古茶树6号的茶氨酸含量在4个古茶树优系中最高，且4个古茶树优系的茶氨酸均高于对照；对照的茶氨酸含量占总游离氨基酸含量的45.9%，8号古茶树占52.2%、古茶树4号53.3%、古茶树2号43.8%、古茶树6号49.1%。

表5 检测茶样中游离氨基酸的含量(mg/g)

福鼎大白茶(ck)茶样8茶样4茶样2茶样6半胱氨酸0.9180.3450.8621.0682.067天冬氨酸0.4280.3180.460.5330.618谷氨酸0.0340.0340.0550.0040.057丝氨酸0.2570.0110.1070.080.086甘氨酸0.0210.2680.1950.0990.096组氨酸0.0110.0530.0580.0070.034精氨酸0.1380.0580.1280.0350.144丙氨酸0.2710.0620.0560.1460.153脯氨酸0.3180.0510.0950.2290.249茶氨酸4.8026.0786.6845.8727.916酪氨酸1.5081.7012.4790.7241.852缬氨酸0.0560.0220.1970.08671.655甲硫氨酸1.3741.9980.7983.2331.264苏氨酸0.0150.0630.0580.0460.053异亮氨酸0.1070.0350.0490.1770.135亮氨酸0.0270.030.0210.1290.035苯丙氨酸0.0560.5010.0960.1290.025赖氨酸0.1070.0120.1280.0260.149总量10.45311.6412.52613.40416.138

3 结论与讨论

本实验采取HPLC法定量分析贵州大学教学实验茶园的2号、4号、6号、8号古茶树优系的游离氨基酸含量，结果发现，古茶树2号、4号、6号、8号的游离氨基酸含量和茶氨酸含量均高于对照福鼎大白，茶氨酸含量占茶叶干重5%以上，含量超过大部分茶叶茶氨酸含量[17]。茶氨酸古茶6号的游离氨基酸和茶氨酸含量最高；其中，古茶4号的茶氨酸含量占总游离氨基酸含量的53.3%，是4个古茶树优系中茶氨酸含量占比最高的，且高于对照福鼎大白茶，这符合茶氨酸是茶叶中含量最高的游离氨基酸的观点[18]。本研究在测定过程中，根据筛选出的溶剂以及色谱条件，以出峰的最大强度和对称性为依据，选择出最适合的流动相为检测器检测波长254 nm；色谱柱流速为1.0 mL/min， 柱温为40 ℃；流动相A为0.1 m无水醋酸钠∶乙腈=93∶7，流动相B为乙腈∶水=8∶2。而张健等研究表明，采用C 18色谱柱，以甲醇和0.05%体积分数的三氟乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，紫外检测波长为208 nm，柱温30 ℃效果最佳[19]，这可能是不同条件配合的结果。

本研究通过优化流动相的方法，建立了一种快速分析古茶树优系氨基酸种类及含量的HPLC检测体系，该检测方法简便、快速，具有较好的应用前景。

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