松龄血脉康联合脉血康预处理对大鼠全脑及血清IL-6表达的影响

梁汝庆， 姜 婧， 丁新生

脑缺血再灌注后，缺血的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞分泌大量的炎性因子，IL-6 是其中很重要的细胞因子[1～4]。大量研究均支持炎症反应参与了缺血性脑损伤，它是由多种细胞因子介导的一种连锁过程[5]。沈等[6]研究结果提示炎症反应遍及全脑并作用全身，贯穿脑缺血再灌注整个病理过程。本实验采用松龄血脉康联合脉血康对大鼠进行4 w预处理，在相同时间点采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察大鼠神经功能缺损状况，检测脑组织和血清IL-6浓度及缺血侧脑组织水含量及梗死体积，旨在了解松龄血脉康联合脉血康预处理对局灶性脑缺血-再灌注后IL-6表达变化以及脑水肿和脑梗死体积的影响，为松龄血脉康联合脉血康在缺血性卒中预防中的神经保护作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SPF级SD大鼠75只，1月龄，体重(110±10)g，由中国科学院上海实验动物中心提供[许可证号SCXK(沪)2007-0005]，在GB14925-2001标准环境饲养。大鼠采用随机数字表法随机分为松龄血脉康预处理组(SL-xmk)，脉血康预处理组(M-xk)、松龄血脉康联合脉血康预处理组(SL-M)、假手术组和生理盐水对照组，每组n=15。SL-xmk组应用松龄血脉康干粉(由成都康弘药业有限公司提供，批号090301)加生理盐水配制成悬浮液灌胃(937.5 mg/kg)[ 7]；M-xk组采用脉血康胶囊(贵州信邦制药股份有限公司，国药准字Z20090723)加生理盐水配制成悬浮液[1000.0 mg/(kg·d)][ 8 ]。SL-M组采用SL-xmk悬浮液[937.5 mg/(kg·d)]加M-xk悬浮液[1000.0 mg/(kg·d)]联合应用，以上三组预防性灌胃4 w。假手术组和生理盐水对照组均给予等容量生理盐水灌胃(1 ml/100 g)，预处理时程同药物预防组。

1.2 MCAO模型制备 在预处理时程终点，参照Longa等[9，10]的方法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，逐层钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，在颈总动脉近心端距分叉处0.5 cm处剪一0.2 mm左右小口，将一段长5 cm，头端加热成直径约0.28 mm光滑球型的4-0号单丝尼龙鱼线栓自颈总动脉切口处插入，轻柔推进，使其沿颈内动脉入颅，线头进入约(18.0±0.5)mm后感到一定的阻力时即停止进线。插线成功后，结扎颈总动脉、颈内动脉固定尼龙线栓，缝合颈部切口。假手术组不插入线栓，其他步骤相同。血流阻断2 h后缓缓拔出线栓，再灌注24 h后处死动物进行各项检测。术中和术后用白炽灯保持肛温(37.0±0.5)℃范围内，直至动物苏醒。

1.3 神经功能评价 动物苏醒后采用Longa等[9]报道的5级标准评分法进行神经功能评价，分别于再灌注2 h、6 h、24 h时评分。0分：无神经功能缺损；1分：缺血对侧前肢内收、不能完全伸展；2分：行走时向偏瘫侧转圈；3分：行走时向偏瘫侧倾的；4分：意识丧失，不能自发行走。≥1分说明模型制作成功，评分0分和4分以及出现癫痫发作和取材时发现脑出血者均剔除，随机补充。

1.4 大鼠血清抽取及脑组织匀浆制备 每组取5只大鼠，末次给药24 h内给予10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔，充分暴露心脏(以5 ml注射器抽取心尖部血液3 ml，37 ℃水浴30 min后，3000 r/min离心10 min，留取血清备用)。开颅取脑，以万分之一电子天平准确称取大鼠缺血区和健侧相同部位脑组织100 mg加入1 ml 0.9%生理盐水，在组织匀浆器中研磨，制备成10%组织匀浆，全部匀浆过程在4 ℃冰浴环境下完成。

1.5 ELISA法检测大鼠脑组织及血清IL-6[6]取备用血清，严格按照ELISA试剂盒说明操作，根据已知浓度的人IL-6(试剂盒提供)进行梯度稀释并测定450 nm吸光度，制定标准曲线。标准及检测标本均采用复孔，复孔测定的吸光度值取均数减去零标准孔吸光度值的均数作为该浓度标准浓度或检测标本的测定值，进一步通过标准曲线和稀释倍数计算出浓度浓度。

1.6 脑水含量和梗死体积百分比的测定[10]脑水含量采用干湿重法检测：每组取5只大鼠，断头取脑，左右脑分开，取右脑，除去小脑和低位脑干和嗅球，立即用双量程电子分析天平称湿重，然后在电热恒温干燥箱中106 ℃干燥48 h后称量干重。脑水含量计算公式为：水含量=(湿重-干重) /湿重×100%。

脑梗死体积采用氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC)染色法检测：每组取5只大鼠，断头取脑，置-4 ℃冰箱30 min，从额极致枕极沿冠状面切成厚度基本相同的5片，脑片避光置于30 ml 2% TTC溶液(Sigma公司)中20 min，然后用10%甲醛溶液固定脑片。正常组织呈红色，梗死脑组织呈苍白色。分离苍白区和非苍白区计算梗死百分比。计算公式为：梗死百分比(%) =苍白区重/(苍白区重 +非苍白区重) ×100%。

2 结 果

2.1 药物预处理对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响 假手术组大鼠神经功能正常。药物预处理组2 h、6 h、24 h神经功能缺损评分较生理盐水对照组均降低(P<0.05)。SL-M预处理组2 h、6 h、24 h神经功能缺损评分较SL-xmk、M-xk组均降低(P<0.05)(见表1)。

2.2 大鼠脑组织和血清IL-6含量 对照组缺血侧脑组织匀浆IL-6浓度明显增高，与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.05)。药物预处理各组缺血侧脑组织匀浆IL-6浓度较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；SL-M组较对照组降低较显著，且优于SL-xmk和M-xk组，差异有统计学意义(P<0.05)。健侧脑组织两者的变化趋势与缺血侧大致相同。假手术组血清IL-6浓度较低[23.08±4.24pg/ml]，对照组大鼠血清IL-6浓度升高，与假手术组比较有统计学意义(P<0.05)；但升高幅度不如脑组织明显。药物预处理各组大鼠血清IL-6浓度与生理盐水对照组相比显著降低(P<0.05)，SL-M组降低更显著，优于SL-xmk和M-xk组(见表2)。

表1 各组大鼠神经功能评分

注：与对照组比较★P<0.05；与SL-xmk、M-xk比较▲P<0.05

表2 各组大鼠脑组织和血清IL-6含量变化

注：与假手术组比较★P<0.05；对照组比较▲P<0.05；与SL-xmk组、M-xk组比较▲▲P<0.05

2.3 脑水含量和梗死率测定 假手术组大鼠脑组织正常，脑水含量为(56.46±5.74)%。药物预处理组脑水含量较生理盐水对照组显著降低(P<

0.05)，梗死体积显著缩小(P<0.05)，SL-M组较对照组降低较显著，且优于SL-xmk和M-xk组，二者相比有统计学差异(P<0.05)(见表3)。

组别例数脑水含量梗死体积假手术组对照组SL-xmk组M-xk组SL-M组5555556.46±5.7487.81±8.65★76.01±7.16▲74.62±7.65▲63.64±6.11▲▲035.61±5.31★28.45±4.47▲27.23±4.58▲20.88±4.28▲▲

注：与假手术组比较★P<0.05；对照组比较▲P<0.05；与SL-xmk组、M-xk比较▲▲P<0.05

3 讨 论

脑梗死后缺血区的炎症反应主要表现在白细胞聚集、氧自由基产生、溶酶体破坏、水解酶生成以及炎症介质形成等方面。脑缺血-再灌注(I-R)时的炎症反应促进了继发性脑损害，随着脑I-R炎症机制研究的深入，炎性细胞和炎性因子在其中的作用越来越受到重视。脑缺血-再灌注后内皮细胞炎症反应使血脑屏障受损，加重了脑损害及脑水肿，此病理生理过程的基础是以IL-6等细胞因子为代表的多种炎性介质失控、释放而形成的“瀑布效应”机制[11]。Vila等[12]应用双夹心 ELISA 法对231例急性脑梗死患者的血清白细胞介素6含量进行检测，并采用Logistic多元回归分析后发现，脑脊液和血清中白细胞介素6是脑梗死的独立预测因子，与体温、血糖、纤维蛋白原和脑梗死体积密切相关，脑梗死体积越大，血清白细胞介素6水平越高，而与脑梗死发生部位无关[13]。

松龄血脉康采用松针、珍珠层粉、葛根等成分，经现代制剂技术加工、精制而成的复方中药制剂；主要有效成分为原花青素、葛根素、总黄酮等，罗氏等[14]通过基因芯片技术发现，松龄血脉康作用于自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)后可促进或抑制许多基因的转录改变，而这些基因在调控脂代谢、氧化应激、细胞凋亡、心肌细胞发育和分化等方面起了重要作用。郭等[15]从氧化应激损伤方面证实松龄血脉康对脑缺血-再灌注损伤有明显保护作用。我们已有研究结果表明松龄血脉康可通过抗细胞凋亡、抑制炎症反应发挥脑保护作用[7，16，17]。国外研究提示松树制剂能刺激e-NOS活性，增加NO浓度，提高血浆前列环素，降低内皮缩血管肽1和血栓烷，扩张血管和抗炎的作用[18，19]。

脉血康胶囊是采用医用水蛭活体经低温冷冻加工而成的胶囊剂，现代药理研究证实水蛭的主要有效成分为水蛭素，由水蛭唾液腺分泌的含65 个氨基酸的酸性多肽，是高度特异的凝血酶抑制剂，与凝血酶结合后，能抑制凝血酶与血栓调节蛋白的结合作用，阻止纤维蛋白原和纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块[20]；水蛭素可降低血液黏稠度，降低血浆中纤维蛋白原的含量[21]；还可降低血小板表面活性，抑制血小板黏附和聚集[22]；其抗凝作用不依赖于抗凝血酶Ⅲ，对已生成的凝血酶也可起作用，故其抗凝活性可能优于肝素[23]。水蛭素是迄今为止世界上发现最强的天然凝血酶特异性抑制剂[24]，由于它安全且没有副作用，因而比肝素更有优越性[25]。

本实验采用松龄血脉康联合脉血康预防性给药，在相同时间点采用线栓法建立缺血-再灌注大鼠模型，模拟人类缺血性卒中再灌注状态，于再灌注2 h、6 h、24 h后观察大鼠神经功能缺损症状，检测脑组织和血清IL-6浓度，同时检测缺血侧脑组织含水量、梗死体积，了解松龄血脉康联合脉血康预处理对局灶性脑缺血-再灌注后炎性细胞因子表达变化、作用部位，以探讨其炎症反应作用机制。

实验结果显示，松龄血脉康联合脉血康预处理后MCAO大鼠，与对照组与单药预处理组比较，联合用药预处理组大鼠神经功能缺损评分降低，全脑及血清中IL-6浓度均降低，与对照组、松龄血脉康、脉血康组比较差异有显著性意义。实验过程中我们观察到松龄血脉康联合脉血康预处理组在MCAO后，缺血侧脑组织含水量、脑梗死体积率均较对照组、松龄血脉康、脉血康组降低，且差异有统计学意义。对照组脑组织和血清中IL-6表达均高于假手术组，提示IL-6是一种致炎细胞因子，缺血早期对脑水肿及脑梗死体积有一定影响，与已有研究相一致[6，26]，我们也发现缺血再灌注大鼠的健侧脑组织同时伴随着高水平的IL-6 表达。这可能是由于：(1)缺血再灌注过程一方面刺激全身性循环系统单核-巨噬细胞系分泌IL-6增加；另一方面缺血再灌注侧局灶性的炎症反应可以通过神经元轴突传递和释放，产生级联效应，激活全脑的炎症反应；(2)缺血侧脑组织水肿导致脑中线移位，健侧脑组织受压、缺血，从而引起炎性因子分泌增加。我们分析可能的机制为：(1)IL-6上调血管内皮细胞和白细胞上的粘附因子(ICAM-1) 的表达，引起血管炎性反应，加重脑缺血；(2)使血脑屏障的通透性增加，脑组织水肿；(3)通过细胞因子的级联效应，加剧脑组织的炎症反应，释放大量的毒性物质，加重神经细胞的坏死[27]。本实验结果显示松龄血脉康联合脉血康预处理后抑制了大脑中动脉闭塞大鼠脑组织中IL-6的高表达，减轻了脑水肿和脑梗死体积，改善了神经功能，降低了全脑及外周血清IL-6的浓度，发挥了一定的抗炎症反应作用。

综上所述，松龄血脉康联合脉血康预处理大鼠MCAO后，血清和脑组织IL-6表达均降低，缺血脑组织水浓度、梗死体积及神经功能均有改善，提示松龄血脉康联合脉血康预处理不仅可抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织IL-6的表达，而且可抑制局部脑组织损伤引起的全身毒血反应，减轻脑水肿和脑梗死体积，改善神经损伤，为松龄血脉康联合脉血康防治缺血性卒中提供了治疗的理论依据。

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