餐厨垃圾中胶原蛋白和几丁质原位降解菌株的筛选与鉴定

李 芸，王李忻，葛梦娇，尹军霞，陈梦娜

（绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴312000）

随着人民生活水平提高、饮食习惯和能源结构的改变，餐厨垃圾在生活垃圾中所占的比例逐年升高，近年我国每天产生的餐厨垃圾约占生活垃圾的50%［1］。目前，城市餐厨垃圾的主要处理方法是生产饲料或者有机肥料，但餐厨垃圾来源分散，收集和运输都很麻烦，而且餐厨垃圾还容易腐败发臭［2－3］，且多数农村没有餐厨垃圾全面的收运和处理系统，大部分的餐厨垃圾直接喂生猪和畜禽，一部分被直接排入就近水系或土壤，或者随同其他生活垃圾一起被填埋处理，严重污染了环境［4］。因此将餐厨垃圾就地产生就地消纳的原位消除技术，是实现餐厨垃圾无害化、减量化和资源化的有效途径［1，5－6］。能针对性地降解餐厨垃圾主要成分的微生物菌剂是原位消除技术的关键。国内外许多学者围绕着降解餐厨垃圾中的淀粉、纤维素、蛋白质、脂类四大类有机物，筛选到了许多原位降解菌株［1－3，6－7］。然而，常见饮食中的鸡爪、鸡翅、猪蹄、鱼皮、肉皮等还会产生含胶原蛋白的餐厨垃圾；水乡或沿海地区餐厨垃圾中虾壳、蟹壳的主要成分是几丁质。针对餐厨垃圾中胶原蛋白和几丁质降解菌的筛选，目前国内外还未见报道。本研究拟筛选能同时降解胶原蛋白和几丁质的降解菌，为餐厨垃圾原位消除技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

从浙江省绍兴市周边农村收集的餐厨垃圾（蟹壳、虾壳、猪蹄、鸡爪、鸡皮等残渣）以及从畜肉市场、屠宰场等处采集的土样、水样。

1.2 培养基配制

富集培养基：明胶 1 g／mL，几丁质 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨5 g／mL，pH值7.2～7.4。

初筛培养基 1：明胶 20 g／mL，NaCl 0.1 g／mL，蛋白胨5 g／mL，KH2PO40.5 g／mL，MgSO40.2 g／mL，琼脂 20 g／mL，pH值7.2～7.4。

种子培养基：牛肉膏 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨10 g／mL，pH值 7.2～7.4。

初筛培养基 2：（NH4）2·SO45 g／mL，KH2PO41 g／mL，MgSO40.25 g／mL，酵母粉 2 g／mL，几丁质 10 g／mL，琼脂20 g／mL，pH值 7.0～7.4。

产几丁质酶培养液：几丁质 5.0 g／mL，蛋白胨 5.0 g／mL，酵母粉 2.5 g／mL，NaCl5.0 g／mL，pH值 7.0。

复筛培养基：几丁质 5 g／mL，蛋白胨 3 g／mL，KH2PO40.3 g／mL，K2HPO40.7 g／mL，MgSO40.5 g／mL，NaCl 5.0 g／mL，pH值 7.0～7.4。

1.3 富集培养

取2 g土样、2mL水样或2mL餐厨垃圾水洗样接种到富集培养基中，37℃、150 r／min摇瓶培养2 d。

1.4 胶原蛋白降解菌的平板初筛和猪皮消化试验

将富集培养液梯度稀释液涂布初筛平板1（初筛培养基1制作的平板）中，37℃培养24 h，按吴琦等的方法［8］平板初筛胶原蛋白降解菌。分别挑取初筛菌株1环，接种于种子培养基中，37℃培养2 d，4 000 r／min离心10 min，取上清液，按吴琦等的方法［8］检测上清液消化新鲜猪皮的效果。

1.5 几丁质降解菌的平板初筛和虾壳消化试验

取消化猪皮效果明显的菌株点种于初筛平板2（初筛培养基2制作的平板）中，37℃培养48 h，取水解圈直径与菌落直径比值较大者进行复筛［9］。挑取几丁质降解菌接种于产几丁质酶培养液中，37℃培养2 d后，4 000 r／min离心10 min。将大小质量基本相同的虾壳洗净晾干，分别装入试管后灭菌，每管加入上清液各10 mL，盖上棉塞，室温放置4 d。另取1管加入10 mL无菌培养液作为对照。

1.6 酶活测定

取消化虾壳效果明显的菌株1环，接种于种子培养基中，37℃、150 r／min培养24 h，再按5%的接种量接种到复筛培养基中，37℃、150 r／min培养48 h。发酵液5 000 r／min离心10 min后，取上清液测定胶原蛋白酶和几丁质酶的活性。

胶原蛋白酶活力测定采用茚三酮显色法［8］，以Ⅲ型胶原蛋白（购自SIGMA公司）作为底物，测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸显色制定标准曲线。在37℃、pH值7.5条件下，1 mL酶液1 min水解胶原蛋白产生相当于1μmol甘氨酸的酶量为1个酶活力单位（U）。

几丁质酶活性测定采用DNS法［9］，1个酶活力单位定义：1 h释放出相当于100μg N－乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

1.7 菌种鉴定

菌种形态和生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》［10］；16S rDNA测序参照乔长晟等的方法［2］。

1.8 餐厨垃圾的原位降解

从绍兴周边收集餐厨垃圾，挑出垃圾中鸡皮、鸡爪、鸡翅、虾壳、蟹壳等残渣装入桶里，每桶装样量为0.5 kg，再按10%的接种量接入选定菌的种子培养液，室外（温度15～25℃）放置48 h，处理前和处理后测定有机质含量（重铬酸钾法），计算降解率。每组3个平行，以接种10%的无菌种子培养液作对照。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白降解菌的平板初筛及猪皮消化试验

筛选到18株消化猪皮效果明显的胶原蛋白降解菌，其中A1、A2、A5、A6、A7、B1、B2、B3、B4、B7、C3等 11株菌消化后的猪皮体积不足对照的1／3（图1），为高效降解胶原蛋白的菌株。

2.2 几丁质降解菌的平板初筛及虾壳消化试验

11株高效降解胶原蛋白的菌株中，B3和C3在含几丁质的平板上产生了明显的透明圈（图2），说明B3和C3能够降解几丁质。B3和C3都能消化虾壳，其中B3将虾壳完全消化成了沙粒大小的碎渣，消化液也因此变得浑浊（图3），表明B3降解虾壳的几丁质酶活性很高。

2.3 复筛

B3的胶原蛋白酶活性和C3差异不显著，而几丁质酶活性显著比C3高（表1）。选取B3作为目标菌进行鉴定。

表1 2株菌酶活性测定结果

2.4 菌种的鉴定

2.4.1 形态鉴定 B3在酪氨酸培养基上菌落呈白色，不透明，圆形，边缘不整齐。革兰氏染色阳性结果见图4。

2.4.2 生理生化鉴定 B3的常见生理生化特征见表2。

2.4.3 16S rDNA测序 B3的16S rDNA PCR扩增产物片段经宝生物工程（大连）有限公司测序，确定片段长度为1 463 bp（GenBank登陆号：KP716831），经过 GenBank核酸数据BLAST分析和 ClustalX 1.8.1比对，使用 MEGA4按Neighbor－Joining法构建系统发育树（图5）。B3与Bacillus subtilis和Bacillus atrophaeus的序列相似性都达99%以上，结合形态（特别是在酪氨酸培养基上菌落无明显黑色素产生）和生理生化特征，B3被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表2 B3生理生化特征

2.5 餐厨垃圾的原位降解

B3原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾2 d后，垃圾中的有机质含量与对照相比，显著降低，降解效果达到24.78%，比对照高 174%（表3）。

表3 B3原位降解餐厨垃圾的效果

3 讨论

餐厨垃圾的微生物原位降解技术，利用微生物在餐厨垃圾的源头进行减量和消纳，不仅可以降低生活垃圾社区和市政收集、运输和处理的难度，还可以制造有机肥料就地用于阳台花园的种植，是餐厨垃圾绿色环保处理方式［11－12］。水乡或沿海地区的餐厨垃圾富含胶原蛋白和几丁质，原位降解这类餐厨垃圾时，高效降解胶原蛋白和几丁质的微生物是关键。国内外一些学者从富含胶原蛋白的环境中筛选到了能降解胶原蛋白的微生物［13－14］，也有很多学者从几丁质的环境中筛选到了降解几丁质的菌种［9，15－16］。本研究首次从餐厨垃圾中分离到了1株既能降解胶原蛋白又能降解几丁质的菌株，该菌室外原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾2 d的降解效果达到24.78%。而且，该菌淀粉水解阳性，如应用在餐厨垃圾的原位降解上，将能发挥同时降解胶原蛋白、几丁质、淀粉的三重功效，具有非常广阔的应用前景。

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