白藜芦醇对过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

杨影 吴峥峥 程依琏 林伟 曲超

四川省医学科学院·四川省人民医院眼科（成都610072）

年龄相关性黄斑变性（age⁃related macular de⁃generation，AMD）是50岁以上人群中视力损伤的主要原因之一。越来越多的证据表明视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化损伤与AMD的发生有密切的联系［1⁃4］。目前药物治疗AMD的研究主要为抗氧化剂的研究如叶黄素、维生素E和胡萝卜素等和活血化瘀类中成药，但效果不确切，因此研究一种预防和治疗AMD的药物势在必行。白藜芦醇是一类主要存在于虎杖、藜芦、葡萄、花生等植物中的非黄酮类多酚化合物，属于植物在抵抗外界刺激而产生的一种植物保护素［5⁃6］，药理学研究表明它具有强大的抗氧化、清除氧自由基以及抗凋亡的能力［7］，但有关白藜芦醇对视网膜色素上皮细胞是否具有抗氧化及抗凋亡活性以及它的作用机制，至今未见报道。本研究采用H2O2对人RPE细胞进行氧化损伤，给予白藜芦醇预处理，研究白藜芦醇对人RPE细胞凋亡有无抑制作用，并探讨可能的作用机制，从而为老年性黄斑变性的防治寻找新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器 白藜芦醇和H2O2溶液（购自美国 Sigma Aldrich公司），RPMI⁃1640培养基、胎牛血清（购自美国GIBCO公司）、CCK⁃8试剂盒（购自美国Sigma公司），超净工作台（购自苏州净化设备有限公司），细胞培养箱（购自美国Shellab公司），Annexin⁃V凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；碘化丙啶购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与培养 遵守快融的原则，将细胞冻存管从液氮罐中取出，置于55～65℃水浴中迅速解冻，取出细胞悬液，注入离心管并加入5 mL的含10%胎牛血清（FBS）的细胞培养液。以800～1 000 r/min离心5 min，除去上清液，加入1 mL培养液吹打，使其形成悬浮液。用含20%FBS的细胞培养液适当稀释后，调整细胞浓度为50×106mL接种到25 cm2培养瓶，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，每2天换液1次，细胞近铺满（80%～90%）时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的人RPE传代细胞接种于6孔板及96孔板中。

1.2.2 实验分组 选取生长良好的第3～5代人RPE传代细胞采用无血清的DMEM培养液培养24 h，同步化后分成3组：第一组为正常对照组，每组3孔，用6 mL DMEM培养液培养细胞；第二组为氧化损伤组，用DMEM培养液培养24 h后将200 μmol/L H2O2加入RPE细胞培养液中制备RPE细胞氧化损伤模型。第三组为白藜芦醇保护组，将50 mg/L白藜芦醇加入RPE细胞培养液中，24 h后加入 200 μmol/L H2O2，将细胞置于 5%CO2培养箱内分别培养2、8、24 h。

1.2.3 CCK⁃8法检测细胞活性 取其第3代，0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，按每孔0.2 mL接种于96孔培养板，37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h，无血清培养液洗涤3次，按上述分组方案进行分组加药，将细胞置于5%CO2培养箱内分别培养2、8、24 h后，弃去接种液，加入CCK⁃8 10 μL，37℃、5%的CO2培养箱中培养4 h后弃液，加入DMSO 100 μL，振荡10～15 min，用酶标仪测光密度A值。计算不同浓度药物作用后对细胞的抑制率。细胞增生抑制率（HA）=（对照组A值⁃实验组A值）/对照组A值×100%。

1.2.4 细胞周期的检测 收集生长良好的人RPE细胞，调整细胞浓度至1×106mL，分别接种于6孔板中培养24 h，按照实验分组处理细胞后，将细胞置于5%CO2培养箱内分别培养2、8、24 h，加入冰浴预冷70%乙醇中固定过夜。弃去乙醇，PBS清洗2次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37℃避光温浴30 min。采用流式细胞仪检测样品，采用Multicycle分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取对数生长期的人RPE传代细胞接种于6孔板培养细胞，5%CO2培养箱孵育24 h后，按照实验分组处理细胞后，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，取5万～10万重悬的细胞，1 000g离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V⁃FITC结合液轻轻重悬细胞。室温（20～25℃）避光孵育10 min。1 000g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V⁃FITC 结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析和Turkey′s多因素t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对人RPE细胞抑制率的影响 通过CCK⁃8法检测发现，50 mg/L白藜芦醇保护组作用2、8、24 h细胞抑制率分别为 17.01%、19.97%、24.58%，明显降低了细胞抑制率，且与氧化损伤组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 白藜芦醇对人RPE细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，氧化损伤组细胞凋亡率显著增高（P＜0.01），经白藜芦醇保护作用2、8、24 h后，与氧化损伤组相比细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 白藜芦醇对人RPE细胞凋亡的影响Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

表1 白藜芦醇对人RPE细胞凋亡的影响Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

注：白藜芦醇保护组和氧化损伤组比较，★P＜0.01；氧化损伤组和对照组比较，△P＜0.01

2 h 8 h 24 h组别正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组凋亡率7.45±0.41 14.24±0.29△9.29±0.03★6.99±0.07 19.28±0.15△10.12±0.09★7.47±0.09 25.60±1.06△18.22±0.69★

2.3 白藜芦醇对人RPE细胞周期的影响 流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，氧化损伤组G0/G1期、G2/M期细胞比例显著增加，S期细胞比例显著减少（P＜0.01）；经白藜芦醇保护作用2、8、24 h后，处于G0/G1期细胞比例和氧化损伤组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；处于S期细胞比例和氧化损伤组相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。图1、表2。

图1 白藜芦醇作用人RPE细胞2、8、24 h后对细胞周期的影响Fig.1 The effect of RPE cells on the cycle of human RPE cells at 2、8、24 h

表2 白藜芦醇对人RPE细胞周期的影响Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

表2 白藜芦醇对人RPE细胞周期的影响Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

注：白藜芦醇保护组和氧化损伤组比较，*P＜0.01；氧化损伤组和对照组比较，△P＜0.01

G2/M 3.2±0.09 18.21±0.13△42.14±0.65*2.04±0.72 32.75±0.79△17.21±0.46*7.58±0.07 51.10±0.47△40.54±0.24*组别正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组正常对照组氧化损伤组白藜芦醇保护组G0/G1 40.22±0.20 55.13±0.08△14.67±0.88*44.91±0.37 48.21±0.45△40.85±0.25*44.23±0.10 47.18±0.35△25.75±0.31*S 2 h 8 h 24 h 56.57±0.12 26.64± 0.22△43.02±0.40*53.05±0.34 19.03± 0.38△41.94±0.23*48.18±0.02 18.70± 0.18△33.71±0.10*

3 讨论

AMD的病因学和发病机制至今未明，目前多数研究认为与老化、氧化损伤、炎症免疫、血管生成及抑制因子失调等因素有关［8］，随着年龄增长，人体抗氧化能力逐渐减弱，RPE细胞位于脉络膜毛细血管层和光感受器细胞层之间，导致其特别容易受到氧自由基的攻击，从而引起AMD等视网膜疾病的发生［9］，已有研究证实，RPE细胞的氧化损伤在AMD的早期即可出现［10⁃11］。氧化损伤往往伴随凋亡的发生［12］，研究发现［13］，RPE氧化损伤的主要靶细胞器是线粒体，其损伤水平取决于活性氧的量。活性氧的释放可以通过诱导REP细胞的凋亡，参与视网膜色素上皮屏障功能的损伤。体外实验也证实［14］，氧化应激可以诱导REP细胞发生凋亡，这可能是AMD早期RPE细胞死亡的一个途径。H2O2是一种极易透过细胞膜的强氧化剂，通过增加细胞内活性氧含量发挥对细胞的氧化损伤作用［15⁃17］。自从20世纪 40 年代以来，白藜芦醇一直颇受医学界的重视，尤其是其抗氧化与自由基能力尤为突出，体外实验发现白藜芦醇能清除多种活性氧簇［18］，但未见报道对RPE细胞保护作用的研究，本实验以活性氧形式之一的H2O2作用于视网膜色素上皮细胞，造成RPE氧化损伤，研究白藜芦醇对RPE凋亡的保护作用。

本研究结果发现H2O2氧化损伤组2、8、24 h细胞抑制率为26.77%、37.81%、66.12%，白藜芦醇保护组作用2、8、24 h细胞抑制率分别为17.01%、19.97%、24.58%，与氧化损伤组相比明显降低了细胞抑制率，且与时间呈依赖性，表明白藜芦醇对体外培养的人RPE细胞氧化损伤有一定的保护作用，能显著降低细胞抑制率。

研究发现，H2O2可导致RPE细胞大量凋亡，而预先加入阳性对照药白藜芦醇培养，可明显抑制RPE细胞凋亡，白藜芦醇保护作用2、8、24 h后，与氧化损伤组相比细胞凋亡率明显降低，说明白藜芦醇保护氧化损伤的RPE细胞，降低细胞抑制率是通过抑制RPE细胞凋亡途径实现。

当细胞的生长被阻滞在某个阶段，细胞就会对损伤的DNA进行修复，如果修复失败，则会发生凋亡，细胞的增殖必然受影响。本实验结果表明白藜芦醇作用于RPE细胞后，处于G0/G1期细胞比例和氧化损伤组相比明显降低，处于S期细胞比例明显升高，表明白藜芦醇在一定程度上可以促进氧化损伤的视网膜色素上皮细胞细胞周期进展，由G0/G1期进入S期，推测白藜芦醇抑制RPE细胞凋亡可能是通过调控细胞周期，诱导细胞由G0/G1期进入S期。

综上所述，白藜芦醇对体外培养的人RPE细胞氧化损伤有一定的保护作用，其机制可能是通过调控细胞周期，诱导细胞由G0/G1期进入S期，从而抑制RPE细胞凋亡，提示白藜芦醇对AMD的预防和治疗有一定的作用。鉴于体外培养的RPE细胞与活体内的RPE有一定差别，对各种损伤的反应也可能会有所不同，所以白藜芦醇对于RPE的保护作用及其在临床上的治疗效果和具体应用还有待进一步研究。

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