基因分型和ABO疑难血型三步分析法鉴定ABO疑难血型1例

柯浩珍

青海省人民医院输血科（西宁810007）

患者女，年龄26岁。于2016年10月28日因“月经”后感头晕，乏力，伴面色萎黄，前往地方医院，血常规化验提示：血红蛋白50 g/L，完善血型及交叉配型后输注A型Rh阳性红细胞悬液3 U，次日复查血红蛋白上升至69 g/L，患者自感头晕乏力有所缓解。2016年11月1日患者再次复查血常规提示：血红蛋白41 g/L，感全身疲乏无力加重，突然出现恶心、呕吐，病情进行性加重，为进一步诊治于2016年11月2日来我院急诊就诊，并以“贫血原因待查”收入血液科。当时急查血常规提示血红蛋白37 g/L，患者血型正反定型结果不符，不规则抗体筛查阳性，直抗实验阳性。骨穿结果是溶血性贫血，结合实验室初步检测结果和患者临床资料来判断ABO正反定型不一致的原因，针对性设计试验进行验证，最终未能确定患者血型。送往省中心血站参比室鉴定结果为：已输入异体血不易确定，随机抽取血样标本寄往江苏省血液中心，通过基因检测，基因型为A102/002，在血型结果未确定前，前后共输注O型Rh阳性洗涤红细胞6 U。材料：标准检测抗⁃A、抗⁃B 血清（上海血液生物，批号：201512125）；ABO标准红细胞（江阴力博医药生物，批号：201609008）；红细胞不规则抗体筛选细胞（江阴力博医药生物，批号：201609005）；抗球蛋白试剂抗IgG+C3d，抗IgG，抗C3d（上海血液生物，批号：20165001）；聚凝胺试剂（合肥天一生物，批号：20151208）；人类ABO血型基因检测试剂盒（PCR⁃SSP法）（批号：201604013）；TIANamp Blood DNA kit血液基因组提取试剂盒（秀鹏生物，Cat。#DP318⁃03，Lot。#P4129）；离心机（日本久保田KA⁃2200型）。

血型血清学试验：经典试管法进行ABO正反定型。经典试管法DAT和IAT。经典试管法抗冷抗体吸收试验。经典试管法磷酸氯喹放散试验。经典试管法自身抗体吸收试验。以上试验都按照《全国临床检验操作规程》（第3版）操作和标准进行结果判断［3］。

ABO疑难血型三步分析法:第1步：复检ABO血型：（1）重新采集血样：分抗凝血和不抗凝血2管，排除血样采错，静脉输液处采样和血样不规范等因素。（2）核对试剂、器材：核对试剂效期，仔细阅读试剂说明书，特别是操作规程和注意事项；核对离心机转速，时间，离心力，以及其他器材有无污染，排除试剂、器材，特别是离心力不标准的干扰。第2步：根据临床资料，结合ABO血型鉴定结果，逐条对照使用排除法进行排除，分析可能导致正、反定型不一致的原因，最终可疑是AIHA、淋巴瘤、自身抗体以及输异型血干扰ABO正反定型。第3步：对不能排除的原因，设计针对试验验证。可疑是AIHA、输异性血，加做血型血清学试验（青海省血液中心参比室协助完成）。

PCR⁃SSP ABO血型基因分型试验按照人类ABO血型基因检测试剂盒（PCR⁃SSP法）说明书操作，首先按照TIANamp Blood DNA kit血液基因组提取试剂盒说明书操作（此试验由江苏省血液中心参比室完成）。

患者直接抗人球蛋白试验IgG+C3d（2+），IgG（2+），C3d（2+）。血型基因分型结果为A102/002型，即该患者的基因分型结果为A型。见表1。

讨论 正确鉴定ABO血型，是确保临床安全输血的关键。在实际工作中经常遇到正反定型不相符致血型鉴定困难的病例，针对此病例正反定型不相符这一情况，采用ABO疑难血型三步分析法对其分析，通过第一步排除人为因素，试剂，仪器等原因和第二步结合临床资料和ABO血型鉴定结果，逐条排除原因后，不能排除原因为：自身免疫性溶血性贫血（AIHA），输异型血，淋巴瘤以及自身抗体，而淋巴瘤被骨穿结果是溶血性贫血得以排除，而自身免疫性溶血性贫血，可分为温抗体型和冷抗体型，其自身抗体具有凝集自身和他人的红细胞，并破坏红细胞，再加上输注了异体血，不排除产生了免疫性抗体，都会影响ABO血型鉴定结果［4］。依次根据疑难血型三步分析法的第三步，对不能排除的原因，针对性地试验验证加做了吸收放散试验、抗冷抗体吸收试验、磷酸氯喹放散试验、自身抗体吸收试验后，但血型鉴定结果还是不易确定，结果见表1，最后通过基因检测，基因型为A102/002。该患者2016年11月2日至2016年11月7日期间输注6 U O型Rh阳性洗涤红细胞。临床综合直接抗人球蛋白等多项实验室检查，以及临床资料分析，确诊为自身免疫性溶血性贫血，合并对症治疗后，于2016年11月9日血清学方法鉴定ABO血型定型为A型RhD阳性。

表1 患者ABO血型正反定型和不规则抗体结果Tab.1 Results of positive,negative and irregular antibody typing of ABO blood group in patients

基因检测技术的特点为稳定，简便，快速，准确，试剂是由化学组成，易于获得标准化，且无需新鲜标本。众多研究表明基因分型是正确判定血型不可缺少的辅助手段，尤其在疑难血型鉴定：如红细胞直接抗人球蛋白试验阳性和具有凝集作用红细胞的血型，通常都会遇到麻烦，在这种情况下可以使用基因分型技术鉴定血型。对于新近输血患者或多次输血患者，由于外周血中含有供者的血液细胞，使用经典的红细胞凝集试验不能正确鉴定血型，也可以使用基因分型方法鉴定。

总之，导致正反定型不符的疑难原因有很多，之前没有规范的方法参考解决这一情况，输血科血型鉴定工作处于思路混乱，无从下手，而ABO疑难血型三步分析法为血型鉴定工作者制定了规范性的原因分析与标准的实验操作规程，给我们提供了一个清晰的思路和试验步骤，可以短时间内正确鉴定出血型，但由于血型血清学技术的局限性，有些疑难血型还是不易确定，ABO基因分型技术可用于弥补血清学技术的不足之处，特别是针对新近输血的患者或直接抗人球蛋白试验为阳性的患者的血型鉴定，所以，二者的结合，在处理疑难血型鉴定时，以最快速度鉴定正确血型，使得输血治疗更加及时安全有效，以提高临床输血医学水平。