中草药对大菱鲆源哈维氏弧菌的体外抑菌效果

2018-05-17张永刚栾林林葛慕湘靳晓敏叶仕根

淡水渔业 2018年3期

张永刚，栾林林，任海，葛慕湘，靳晓敏，叶仕根

(1.大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023；2.河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北昌黎 066600)

随着水产养殖业的不断发展，特别是高密度养殖技术的推广，水产养殖动物疾病时有爆发，为鱼类疾病防治提出了新的问题[1]。哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是一种革兰氏阴性发光细菌，广泛存在于海洋环境与水产动物的体内外[2]，是水产养殖动物的重要致病菌。该菌可感染鱼、虾和贝类等重要水产经济动物[3]，在澳大利亚、厄瓜多尔及中国等国家均有发生[4-6]，给海水养殖业造成巨大的经济损失。

中草药不仅具有绿色环保、不易产生耐药性及性能多样化的优点，还具有预防疾病发生和提高非特异性免疫力等功效[7]。在水产养殖中，中草药使用广泛，对细菌性、病毒性、寄生虫性疾病都有相应的配方并具有良好的效果[8-9]。因此，应用中草药防治鱼病越来越受到人们的关注。本试验选取石榴皮、五倍子和大黄等18种常见中草药开展了哈维氏弧菌的体外抑菌作用，从中筛选出对哈维氏弧菌有较好抑制作用的中草药，旨在为该菌引起的爆发性鱼病的防治工作提供依据，并为开发中草药应用于水产养殖业的疾病防控提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验用菌(编号：HQ150310-1)由河北科技师范学院重点实验室提供，分离自患病大菱鲆的肝脏，经回归感染试验确认为其致病菌，经形态特征、理化特性及16S rRNA基因序列测定鉴定为哈维氏弧菌，菌株于-80 ℃甘油中保藏。将该菌转接于营养琼脂培养基，28 ℃培养24 h ，再用肉汤培养基28 ℃培养24 h后用无菌生理盐水稀释至1.5×108CFU/mL菌悬液备用。

1.1.2 试验用药

用于实验的中草药:五倍子(Rhuschinensis)、大黄(Rheumpalmatum)、鱼腥草(Houttuyniacordata)、石榴皮(Pericarpiumgranati)、穿心莲(Andrographispaniculata)、乌梅(Darkplumfruit)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、公丁香(Syzygiumaromaticum)、辣蓼(Persicariahydropiper)、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、陈皮(Pericarpiumcitrireticulate)、薄荷(MenthahaplocalyxBriq)、黄柏(Phellodendronchinense)、桉树叶(Eucalyptusrobusta)、黄连(Coptischinensis)、石菖蒲(Acorustatarinowii)、马齿苋(Portulacaoleracea)、苏木(Caesalpiniasappan)。这18种中草药均购自安国市神禾中药材饮片有限公司。

1.1.3 培养基

普通营养琼脂(批号为140811)、肉汤培养基(批号为CM106)，均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 中草药原液的制备

18种中草药各取100 g，各加入500 mL 的蒸馏水浸泡1 h，加热煮沸60 min，药汁经4层纱过滤后倒出药液，将药渣再各加入500 mL 的蒸馏水，加热煮沸60 min，过滤后倒出药液，将两次药液合并蒸发浓缩到100 mL 即制成药物浓度为1 g/mL的中草药原液。经过高压灭菌121 ℃15 min后，将无菌药液置于冰箱中冷藏备用[10]。

1.2.2 药敏纸片的制备

用打孔器将定量滤纸片制成直径为6 mm的滤纸圆片，装入直径60 mm的平皿中，120 ℃干热灭菌2 h后备用。将制备好的稀释药液注入有纸片的灭菌培养皿中(每个纸片的饱和吸水量按0.01 mL计)，并翻动纸片使各纸片充分浸透药液，浸泡5～10 min后用无菌镊子将纸片上的药液在平皿上沥干，平摊于无菌平皿内，置37 ℃恒温箱内烘干约2 h，分别装入青霉素小瓶内，同时在瓶上贴药名标签，置于4 ℃冰箱内备用[11]。

1.2.3 纸片法药敏试验

用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布于营养琼脂平板表面，将含药纸片均匀贴于琼脂表面，每个培养皿贴6片，之后28 ℃培养24 h，用直尺测量抑菌圈直径,每孔取不同方向测量4次，取其平均值，每种药物3个平行。抑菌圈直径≥20 mm为极敏，直径在15～20 mm之间为高敏；直径在10～15 mm之间为中敏；直径小于10 mm为低敏[12-13]。

1.2.4 最小抑菌浓度测定

最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)为抑制细菌生长的药液最小浓度。采用二倍稀释法测定这18种中草药的药物的最小抑菌浓度(MIC) 。将每种中草药作为一组，一组13 个无菌试管，贴上标签，在无菌条件下配制13 组中草药原液浓度梯度。用无菌微量移液器吸取50 μL菌液接种到各浓度梯度的试管中，每种药物做3个平行。接种后将试管置于28 ℃恒温振荡器上振荡培养24 h 后观察，用无菌棉签将每个不同浓度梯度的药液接种于普通培养基上，每种药物3个重复，置于 28 ℃恒温培养箱中培养24 h。肉眼观察，药物最低浓度无细菌生长者，即为该药的MIC[12]。同时设置不添加药液的空白管作为对照。

1.2.5 最小杀菌浓度的测定

将各种药物的MIC 和高于MIC 浓度的试管中，吸取0.1 mL 培养物转接于牛肉膏琼脂斜面培养基上，28 ℃培养2 d 后观察有无菌落形成，无菌落形成的相应试管中的药物浓度即为该种药物对该菌株的最小杀菌浓度(MBC)[11]。

2 结果

2.1 18 种中草药对哈维氏弧菌的抑菌效果

由所得的结果(表1)可见，在同种浓度下，苏木、大黄、五倍子、乌梅、石榴皮五种中草药对哈维氏弧菌的抑菌作用最明显，药效持久，为理想的抑制该菌药物；黄连、马齿苋、桉树叶的抑菌作用明显；公丁香、鱼腥草、穿心莲的抑菌效果中等，沙棘、黄柏、辣蓼、甘草、薄荷这5 种药物抑菌直径小，抑菌效果不明显；而陈皮、石菖蒲则无抑菌现象出现。

表1 18种中草药对哈维氏弧菌的抑菌效果Tab.1 Inhibitory effect of 18 kinds of Chinese herbal medicines to V.harveryi

2.2 中草药对哈维氏弧菌的杀菌浓度

由表2 可见：苏木、大黄、五倍子、乌梅、石榴皮的MIC 均<12.5 mg/mL ，从而得知苏木、大黄、五倍子、乌梅、石榴皮的抑菌作用非常明显。由表2和表3 可见，药品最小杀菌浓度(MBC) 均> 最小抑菌浓度(MIC) ，在五倍子等18种中草药中五倍子、石榴皮、苏木在50 mg/mL 均表现出杀菌作用，大黄、乌梅在100 mg/mL 时表现出杀菌作用，黄连、马齿苋、桉树叶、公丁香、鱼腥草、穿心莲在25 mg/mL 时表现出杀菌作用，沙棘、黄柏、辣蓼、甘草、薄荷在500 mg/mL 时才表现出杀菌作用，其余药物在500 mg/mL 没有杀菌现象。可见，五倍子、大黄、石榴皮、苏木、乌梅是较好用于防治哈维氏弧菌引起的疾病的中草药。

表2 18种中草药对哈维氏弧菌的抑菌浓度Tab.2 The inhibitory concentration of 18 kinds of Chinese herbs on V.harveryi

注：“3”表示高度浑浊，“2”表示中度浑浊，“1”表示有菌生长，“0”无菌生长

表3 18种中草药对哈维氏弧菌的杀菌浓度Tab.3 Bactericidal concentration of 18 kinds of Chinese herbal medicines of V.harveryi

注：“+ ”表示有菌生长，“-”表示无菌生长

3 讨论

3.1 中草药的抑菌效果

水产动物疾病大多采用抗生素类化学药物控制,但存在不易降解、易在养殖动物体内富集和污染环境等问题,长期的使用还可能会导致许多鱼类病原细菌产生耐药性甚至多重耐药性[12]。中草药因其绿色环保、不易产生耐药性而受到关注。本试验挑选18种常用中草药,以患病大菱鲆分离得到的哈维氏弧菌为试验菌,进行抑菌药物的筛选。试验结果表明，中草药水煎液对哈维氏弧菌的体外抑菌效果明显，其中苏木、大黄、五倍子、石榴皮、乌梅的抑菌作用最强，抑菌圈直径均在20 mm以上，MIC为12.5～25 mg/mL，MBC分别为50～100 mg/mL。金珊等[14]研究了15种中草药对海水网箱养殖的鲈皮肤溃疡病病原哈氏弧菌的抑菌效果发现15种中草药均有一定抑菌作用，其中石榴皮、地榆、五味子抑菌效果最好，最小抑菌浓度分别为1∶640、1∶320、1∶320；梁利国等[15]用4种常用中草药对病原弧菌(鳗弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、河口弧菌)体外抗菌效果作出了研究，其中苏木、五倍子、地锦草、石榴皮4种中草药具有较好的抑菌和杀菌作用，MIC和MBC分别为1.56～3.12 mg/mL和3.12～6.25 mg/mL。本试验抑菌效果较强药物与其相类似，但抑菌浓度却是其10倍以上，可能是不同菌种间对药物的敏感性有差异，这点从梁利国等[15]对四种弧菌的测定结果也有所证实；也可能由于试验方法、药液的熬制方法不同，造成结果有所差异。关于中草药原液的制备、药敏纸片的制备目前尚缺乏统一标准方法，试验方法尚处于摸索阶段，所以在不同文献中病原菌对同一种中草药的敏感性存在差异。标准的试验方法还有待于进一步规范。

3.2 体外抑菌试验结果在生产应用中的局限性

目前，用中草药防治水产动物病害是一个研究热点，但在实验室得出的体外抑菌试验结果应用于实际生产时，效果并不一定十分理想。其原因是体外抗菌效果往往与体内效果并不完全一致，中草药的不同来源及其提取方法等都会对药效产生影响。另外，在实际生产应用中，除了考虑药物的高效外，还应考虑鱼体对该药物的耐受能力。正确用药浓度范围应是既能有效抑制病原菌生长又不至于超过鱼体对该药物的耐受力范围。从结果来看，苏木、大黄、五倍子、乌梅、石榴皮抑菌圈直径最大(≥20 cm)，抑菌和杀菌效果较强。但本试验只进行了中草药的体外抗菌试验，其结果可作为防治哈维氏弧菌感染的依据，在实际生产中的应用效果有待进一步验证。

当今社会正在向着环保、健康、自然的方向发展，水产业也不例外。中草药被作为“绿色药品”日益广泛应用于水产动物养殖[16-18]。我们相信，随着中医理论与现代高科技的有效结合，中草药在水产中的应用必将再上一个新台阶，给水产养殖业带来更大的经济效益。

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