Zika病毒NS3具有依赖于ATP水解的dsDNA解链活性

徐 杉，王蕾杰，石 磊

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)

Zika病毒为黄病毒属、单股正链的RNA病毒。近几年，Zika病毒的爆发严重危害了人类健康。研究发现，孕妇感染Zika病毒与新生儿小头症的发病率升高密切相关[1]。此外，Zika病毒会损害小鼠睾丸的发育[2]，从而影响生殖系统。因此，Zika病毒成为威胁人类健康的重大挑战。Zika病毒侵入细胞后，其基因组RNA通过翻译产生3种结构蛋白(C蛋白、prM蛋白和E蛋白)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[3]。结构蛋白作为病毒结构的组成部分，参与病毒组装；非结构蛋白的协调作用在病毒蛋白成熟、基因组复制及病毒组装中起着重要作用。

Zika病毒进入细胞后，病毒基因组(+)RNA首先在NS5 RNA聚合酶的作用下复制形成双链RNA，该双链RNA随后被NS3解旋形成单链，NS5以(-)RNA为模板继续进行复制，产生(+)RNA[4]。因此，研究Zika病毒NS3的ATP水解和核酸解链功能有助于阐明病毒复制机制，为抑制Zika病毒感染提供新的药物设计思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：trans5α感受态细胞(全式金生物技术公司)；BL21感受态细胞(自制)。

1.1.2 试剂：卡那霉素、IPTG、DTT和ATP(Amresco公司)；RNaseA(TaKaRa公司)；DNaseI(北京瑞达恒辉科技发展有限公司)；His抗体(EMAR公司)；ATPase检测试剂盒(Bioassay Systems公司)；合成标记的DNA(cy3-GCGTCTTTACGGTGCTTAAAACAAA ACAAAACAAAACAAAA和AGCACCGTAAAGACG C-BHQ2)(梓熙生物技术有限公司)；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)；quick-change体系(Phanta公司)；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；限制性内切酶、CIP和T4 DNA连接酶(NEB公司)；Ni琼脂糖珠子(Qiagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Zika NS3表达载体的构建：50 μL PCR体系：模板100 ng，10 μmol/L引物1.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dNTPs 4 μL，5×缓冲液10 μL，ddH2O补齐体积。NS3引物序列：上游为5′-CGGAATTCGGTGGC AGCGAGAACTTGTATTTCCAGGGAGGTGGTAGTGGA GCTCTATGGGATGTGC-3′，下游为5′-CCGCTCGAGT TACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCTCTTT TCCCAGCGGCA-3′。PCR扩增程序为：95 ℃变性4 min，1个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃继续延伸5 min，1个循环。反应结束后，PCR产物利用胶回收试剂盒回收。回收的产物与pET-28a载体均用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切过夜。载体酶切后加入1 μL CIP酶，置于37 ℃消化1 h，然后进行电泳及胶回收；PCR产物酶切后直接回收。回收后的载体和片段利用T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化trans5α感受态中，挑取单克隆菌落接菌，提取质粒后测序。

1.2.2 NS3蛋白诱导表达：将NS3表达载体转入BL21，挑取单克隆菌落于5 mL LB培养基中培养，过夜后转入1 L LB中，培养至OD600=1，加入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG。然后将菌置于16 ℃，150 r/min条件下继续培养24 h。诱导结束后，6 000 r/min，离心10 min收集菌体，-20 ℃保存。

1.2.3 NS3蛋白纯化：使用30 mL裂解缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5% Triton X- 100，20 mg/L RNaseA，20 mg/L DNaseI，10%甘油，1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin，1 mg/L pepstatin，1 mg/L aprotinin)重悬菌体。冰上超声裂解，总功率200 W，超声5 s，停7 s，共超声20 min。超声结束后，4 ℃18 000 r/min离心45 min。取上清，加入Ni琼脂糖珠子，4 ℃结合4 h后，离心后弃上清，将珠子转移至柱子中，用含30 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.4 mmol/L DTT，30 mmol/L咪唑)洗2次，再用含60 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗2次，然后加入洗脱缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，500 mmol/L咪唑，1 mmol/L DTT)洗脱。最后，蛋白用2 L透析缓冲液(100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，1 mmol/L DTT)透析过夜。

1.2.4 ATPase活性检测：使用无色透明96孔板，参照试剂盒说明书进行实验。先配制标准磷酸根溶液，用于制作标准曲线。然后将NS3用透析缓冲液稀释成200 nmol/L，将ATP分别稀释成2、1、0.4、0.32和0.2 mmol/L。实验组反应体系为：20 μL反应缓冲液，10 μL酶，10 μL ATP，对照组用透析缓冲液代替酶。反应30 min后，每孔加入200 μL显色液，30 min后使用酶标仪检测A620。

1.2.5 核酸解链实验：将合成的ssDNA用退火缓冲液(100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，2 mmol/L MgCl2)溶解，配成10 μmol/L母液。配制600 μL退火体系：30 μL cy3标记的核酸，30 μL BHQ2标记的核酸，退火缓冲液补齐。将体系避光放于95 ℃水浴中加热5 min后，自然冷却至室温，即得到dsDNA。每个解链反应体系为100 μL，包含50 nmol/L退火产物，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，10 mmol/L NaCl，0.1 g/L BSA，5 mmol/L MgCl2， 500 nmol/L NS3，混匀后加入全白不透明96孔板中。用酶标仪检测溶液的荧光值[酶标仪参数：激发光550 nm，发射光620 nm，临界值(cutoff值)610 nm]，待荧光值稳定后，每孔加入终浓度为5 mmol/L的ATP以及500 nmol/L的竞争剂(GCG TCTTTACGGTG CT)，检测荧光值的动力学变化。

1.2.6 利用quick-change获得NS3 G198A表达载体：20 μL反应体系如下：模板200 ng，10 μmol/L引物1.5 μL(上游引物序列：5′-CTTGCATCCTGGAGCT GCAAAAACCAGGAGAGTTC-3′；下游引物序列：5′-G AACTCTCCTGGTTTTTGCAGCTCCAGGATGCAAG-3′)，phanta DNA聚合酶1 μL，dNTPs 1 μL，2×缓冲液10 μL，加ddH2O补齐体积。PCR程序为：95 ℃变性4 min，1个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，18个循环；72 ℃继续延伸10 min，1个循环。反应结束后，加入DpnⅠ酶消化模板。然后将反应产物转化trans5α。挑取单克隆，摇菌培养，提质粒后测序。

2 结果

2.1 Zika NS3蛋白的表达和纯化

Zika NS3原核表达克隆构建成功后，转化大肠杆菌BL21菌株，利用Western blot检测Zika NS3蛋白在大肠杆菌的表达(图1A)。然后用Ni琼脂糖珠子对蛋白进行亲和纯化，得到较纯的Zika NS3全长蛋白，其分子质量约为80 ku，与理论计算的NS3分子量相符(图1B)。

A.Western blot；B.Coomassie blue staining图1 Zika NS3在大肠杆菌中的表达纯化Fig 1 Expression and purification of Zika NS3 in E. coli

2.2 Zika NS3在体外具有ATP水解活性

Zika NS3水解ATP的结果以双倒数曲线方程的形式呈现(图2)。在该反应条件下，Zika NS3具有ATPase活性，其对ATP水解的最大反应速率为2.76 μmol/(L·min)，Km值为0.11 mmol/L。

图2 Zika NS3在体外对ATP的水解活性Fig 2 ATP hydrolysis activity of Zika NS3 in vitro

2.3 Zika NS3在体外具有对dsDNA的解链活性

核酸解链系统利用FRET原理(图3A)，将核酸单链末端分别带上Cy3荧光基团和BHQ2淬灭基团，当二者退火形成双链时，Cy3荧光被BHQ2吸收；当双链被解开后，Cy3荧光被检测到。实验发现，相比不加蛋白的对照组，加入Zika NS3的实验组随着反应时间延长，Cy3荧光值显著增加，解链发生(图3B)。

A.system principle；B.dsDNA unwinding图3 Zika NS3在体外对dsDNA的解链活性Fig 3 dsDNA unwinding activity of Zika NS3 in vitro

2.4 Zika NS3 G198A表达纯化

Zika NS3 G198A突变体在大肠杆菌BL21中可以被较好的诱导表达。通过Ni柱亲和纯化可以得到较纯的G198A蛋白(图4)。

图4 Zika NS3 G198A表达纯化Fig 4 Expression and purification of Zika NS3 G198A

2.5 Zika NS3 G198A水解ATP的活性显著降低

使用等量的Zika NS3野生型(WT)和G198A进行ATP水解反应，结果发现G198A对ATP的水解速率显著低于NS3 WT(图5)。

2.6 Zika NS3 G198A对dsDNA的解链活性降低

使用等量的Zika NS3 WT和G198A进行dsDNA解链实验，结果发现G198A对dsDNA的解链速率明显低于NS3 WT(图6)。

图5 Zika NS3WT与G198A对ATP水解活性比较Fig 5 Comparision of ATP hydrolysis activity between Zika NS3 WT and G198A

图6 Zika NS3 WT与G198A对dsDNA解链活性比较Fig 6 Comparision of dsDNA unwinding activity between Zika NS3 WT and G198A

3 讨论

除了Zika病毒，黄病毒还包括登革热病毒和乙型脑炎病毒等。经过长期研究，这些黄病毒NS3蛋白的结构和功能已被广泛熟知[5]。NS3蛋白N端蛋白酶(protease)结构域主要发挥蛋白酶功能，通过切割病毒自身蛋白，帮助病毒成熟，此外还能切割宿主细胞免疫相关因子，帮助病毒存活[6- 7]。C端解旋酶(helicase)结构域通过水解ATP供能，解旋双链核酸[8]。NS3与NS5相互配合，共同实现病毒基因组的复制。但目前，对于Zika病毒NS3的研究主要局限在结构方面，而对其功能的研究少有报道[9]。

在本研究中，首先通过大肠杆菌表达和亲和纯化，得到了Zika NS3蛋白。然后对Zika NS3本身的ATP水解活性和dsDNA的解旋活性进行了检测。结果发现，Zika NS3同其他黄病毒NS3一样[6]，在体外均具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，可以水解ATP并解链dsDNA。

黄病毒NS3对核酸的解链需要ATP水解供能。因此抑制NS3的ATP水解活性可以抑制其核酸解旋活性。已有研究发现，登革热病毒NS3 G198A突变体的ATP水解活性和核酸解旋活性，相比野生型NS3均明显减弱[10]。通过序列比对，将Zika NS3蛋白的该位点进行突变，得到Zika NS3 G198A突变体，并对其酶活性进行研究。结果发现，同登革热病毒NS3一样，Zika NS3 G198A的ATP水解活性以及dsDNA的解旋活性均受到明显抑制。经分析，NS3 G198A通过抑制ATP水解进而抑制了dsDNA解链。之所以G198A对核酸解链的抑制效果低于对ATP水解的抑制效果，可能是由于实验所用dsDNA双链长度较短，只需要较少的ATP供能，便可以达到解链效果。

综上所述，Zika NS3蛋白在体外具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，且NS3 G198A突变体通过影响NS3的ATP水解活性影响其对dsDNA的解链活性。该结果有助于阐明Zika病毒复制机制，为抑制Zika病毒感染提供新的思路。

参考文献：

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