葡萄糖二酸钙对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及机制研究

詹明，余晶波，杨军

糖尿病及其并发症在全世界范围内的发病率不断上升，已成为危害人类健康的主要疾病。糖尿病肾病（DN）是糖尿病的主要微血管并发症之一，是决定糖尿病患者预后的一个主要因素。高血糖环境可导致肾小球和肾小管间质的细胞外基质积聚，肾血管壁的增厚和透明化[1]。大量研究表明肾小管的损伤和肾小球病变同样重要，且前者是预测DN疾病进展和预后的重要指标[2]，然而目前仍缺少有效治疗糖尿病肾小管病变的药物。近期研究发现一种在肾小管中特异表达的蛋白，命名为肌醇加氧酶，它可将肌醇分解代谢为D-葡萄糖醛酸盐以进入戊糖磷酸途径[3]。除了催化葡萄糖中介体的作用之外，肌醇加氧酶被证实和DN发病机制密切相关[4]。体内外实验显示高葡萄糖环境下，肌醇加氧酶的激活诱导肾小管细胞的氧化损伤和死亡，从而引起DN的发展和恶化[5]。因此，寻找一种能抑制肌醇加氧酶的药物将给DN的治疗带来新的希望。国外学者发现，葡萄糖二酸钙是肌醇加氧酶潜在的药理学抑制剂[6]。该药物被认为具有肾脏保护作用，但对DN的治疗作用和机制仍未知，相关文献报道十分有限。因此，本研究通过建立DN大鼠模型，观察葡萄糖二酸钙对糖尿病大鼠肾脏的影响和药物疗效，并探讨其作用的机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选用8周龄的SD大鼠30只作为实验组，分为链脲佐菌素（STZ）诱导的DN加安慰剂组（STZ+安慰剂组）和STZ诱导的DN加2%葡萄糖二酸钙治疗组（STZ+药物组），另留取10只大鼠作为正常对照组。通过每天向大鼠腹腔内注射STZ（50 mg/kg）连续5 d诱导糖尿病状态，注射后1周选择血糖水平＞250 mg/dl的大鼠作为 DN大鼠模型开始进行安慰剂或药物治疗，并在8周后处死。其中，2%葡萄糖二酸钙为大鼠膳食食物中含质量占2%的葡萄糖二酸钙。

1.2 实验方法 实验组经安慰剂或葡萄糖二酸钙药物治疗8周后，取尾静脉血通过Bioassay试剂盒进行常规的血生化检测，包括血糖水平，反映肾功能指标的血清肌酐和血清尿素氮水平，同时留取大鼠尿液进行尿微量白蛋白与尿肌酐比值（尿ACR）检测。

在留取血液和尿液标本后，处死大鼠，并取出肾脏组织分别制备石蜡标本和电镜标本。石蜡标本制备通过将肾脏组织以4%多聚甲醛固定，经乙醇脱水，石蜡包埋和切片，制成3m石蜡组织切片。切片进行HE和PAS常规组化染色后，在光镜下行肾脏的病理学检查，并进行定量评分。肾小球和肾小管损伤等级评分采用0～3分的肾脏形态损伤评分系统：0分为没有肾小球/肾小管损伤；1分为＜25%的肾小球/肾小管损伤；2分为25%～50%的肾小球/肾小管受累；3分为50%及以上的肾小球/肾小管面积受累。此外，将石蜡组织切片进行肌醇加氧酶的免疫组化染色，通过去抗原，孵育一抗二抗，DAB染色和苏木素复染等步骤，观察肌醇加氧酶在不同组中的蛋白表达水平差异。

用于电镜的组织标本以2.5%戊二醛固定，经脱水、包埋、超薄切片及染色等制备电镜标本，在透射电镜下检测。电镜定位大鼠的近端肾小管上皮细胞，主要观察不同组肾小管细胞中线粒体的动力学形态，测量线粒体的长度，＜1m为断裂的线粒体，一个细胞若60%以上线粒体断裂为线粒体断裂细胞。统计发生上述线粒体断裂的肾小管细胞数百分比。

1.3 统计方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生化指标比较 STZ+药物组的血糖水平比 STZ+安慰剂组低，但差异无统计学意义（P＞0.05），而STZ+药物组血肌酐、血尿素氮和尿ACR水平均显著低于STZ+安慰剂组（均P＜0.05）。见表1。

2.2 两组肾脏病理损伤评分和线粒体断裂指标比较STZ+药物组的肾小球损伤评分和肾小管损伤评分均显著低于STZ+安慰剂组（均P＜0.05），且肾小管损伤的减轻程度更大；STZ+药物组含线粒体断裂肾小管细胞百分比低于STZ+安慰剂组（P＜0.05）。见表2。

表1 两组生化指标比较

2.3 肌醇加氧酶蛋白表达水平比较 将未进行干预的空白对照组和两组实验组的肾脏石蜡标本行肌醇加氧酶免疫组化染色，并进行蛋白表达水平比较。正常对照组的肌醇加氧酶表达水平很低，而STZ+安慰剂组的表达水平显著升高，在STZ+药物组中肌醇加氧酶表达水平较STZ+安慰剂组低。见封二彩图1～3。

表2 两组肾脏病理损伤评分和线粒体断裂指标比较

图1 正常对照组肾脏肌醇加氧酶表达（IHC染色，×200）

图2 STZ+安慰剂组肾脏肌醇加氧酶表达（IHC 染色，×200）

图3 STZ+药物组肾脏肌醇加氧酶表达（IHC 染色，×200）

3 讨论

大鼠的糖尿病及其肾血管并发症中都具有保护作用[9]。本研究结果显示，葡萄糖二酸钙具有治疗DN的疗效，且这一治疗作用的机制可能是通过抑制肌醇加氧酶，从而部分恢复肾小管细胞线粒体异常形态，从而减少肾小管的氧化损伤和细胞凋亡。在大体病理上体现为肾小管损伤减轻，并通过管球反馈影响肾小球的病理改变。因此，本研究揭示了葡萄糖二酸钙这一新型药物对 DN动物的治疗作用及其机制，提示该药物具有良好的临床应用前景，并为今后的临床药物试验奠定了坚实的实验基础。

近年来，DN以肾小球病变为主的传统观点已逐渐改变，研究热点逐步转移到了肾小管间质损伤，且这种损伤被描述为“糖尿病肾小管病”[2]。在体内外实验中，靶向治疗肾小管可明显改善糖尿病引起的蛋白尿和肾功能情况，并延缓疾病的进展，提示肾小管损伤和肾小球病变在DN的发病机制中同样重要，且两者具有协调作用[7]。因此，探索发现针对肾小管的药物对有效治疗DN十分必要，且具有很大的临床实用价值。

既往研究已经证明，肌醇加氧酶是一种特异性定位在肾小管的氧化还原调控蛋白，在高血糖环境下肌醇加氧酶的表达上调可以通过转录机制调节氧化还原失衡，并且可以诱导线粒体依赖性细胞凋亡，这必然会导致肾小管间质损伤和纤维化[4-5]。而近期有学者发现葡萄糖二酸钙这一药物对肌醇加氧酶的蛋白表达和活性有明显抑制作用，且可以通过抑制肌醇加氧酶使线粒体形态结构正常化，这一事实表明葡萄糖二酸钙在治疗DN方面具有很大的潜力[8]。

值得注意的是，葡萄糖二酸钙是一种天然化合物，在西兰花、菠菜及苹果等蔬菜和水果中大量存在，其具有抗癌作用。每天补充葡萄糖二酸钙这一活性成分具有较强的解毒和抗氧化功能，其主要作用机制可能是通过其增强机体对毒素和致癌物的解毒能力。此外，葡萄糖二酸钙的衍生物近来已被报道在

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