直肠癌及癌前病变患者外周血髓源抑制细胞的表达及其临床意义△

张勇超，李潜，谢建国，王家祥，韩广森，张永磊，张金岱

郑州大学附属肿瘤医院1普外科，2超声科，郑州 450008

3郑州大学第一附属医院小儿外科，郑州 450052

直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，大多数直肠癌是由腺瘤恶变而来，目前人们已广泛认同“腺瘤—腺癌”的演变过程。近年研究发现，髓源抑制细胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中聚集，抑制机体的肿瘤免疫，在肿瘤的免疫逃逸机制中发挥重要作用[1-4]。至今为止，国内外尚缺乏直肠癌及癌前病变患者MDSC的研究报道，本研究以健康体检者、直肠增生型息肉、直肠绒毛状腺瘤及直肠癌患者的外周血为样本，通过流式细胞技术检测MDSC、T淋巴细胞亚群以及调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的比例，探讨MDSC促进“直肠腺瘤—直肠腺癌”演变的免疫机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采用随机抽样法，收集郑州大学附属肿瘤医院普外科2015年11月至2016年8月收治的155例直肠疾病患者的外周血标本。根据患者肠镜及病理学检查结果分为3组：直肠增生型息肉组45例，直肠绒毛状腺瘤组52例，直肠癌组58例。所有患者均有明确的病理诊断，均为首次诊断且未行化疗、放疗、手术、靶向治疗等抗肿瘤治疗，既往均无感染性疾病、免疫系统疾病病史。同时，收集郑州大学附属肿瘤医院40例健康体检者的外周血标本，作为健康对照组。

1.2 主要试剂

淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司。红细胞裂解液、藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）标记的鼠抗人CD3单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、藻红蛋白-羰花青-5（P-phycoerythrin-Carbocyanine-5，PE-CY-5）标记的鼠抗人CD8单克隆抗体、PE-CY-7标记的鼠抗人CD11b单克隆抗体、PE-CY-5标记的鼠抗人CD33单克隆抗体、PE-CY-5标记的鼠抗人HLA-DR单克隆抗体、人Treg染色试剂盒及IgG同型对照抗体均购自美国BD公司。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 流式细胞术检测

经肠镜及病理学检查后，患者于清晨空腹抽取静脉血3 ml，肝素抗凝，用于流式细胞术检测。

Treg检测：取静脉血2 ml，以淋巴细胞分离液收集单核细胞，然后取细胞悬液100 μl（细胞数约为1×106个），依据Treg染色试剂盒说明书的指导步骤进行操作，透化缓冲液洗涤后，以适量流式染色缓冲液重悬染色细胞，行流式细胞术检测。

CD4+、CD8+T淋巴细胞检测：取100 μl静脉血置于流式管中，加入荧光标记抗体CD3-PE、CD4-FITC、CD8-PE-CY-5各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入红细胞裂解液2 ml，避光室温孵育10 min，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后，以适量流式染色缓冲液重悬染色细胞，行流式细胞术检测。

MDSC检测：取100 μl静脉血置于流式管中，加入荧光标记抗体HLA-DR-PE-CY-5、CD33-PE-CY-5、CD11b-PE-CY-7各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入红细胞裂解液2 ml，避光室温孵育10 min，PBS洗涤后，以适量流式染色缓冲液重悬染色细胞，行流式细胞术检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析及Post-hoc检验（SNK法），两组间比较采用独立样本t检验，相关分析采用Pearson检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDSC及Treg比例的比较

4组患者MDSC及Treg比例比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）；直肠癌组MDSC及Treg比例最高，直肠绒毛状腺瘤组、直肠增生型息肉组及健康对照组依次下降，进一步两两比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

表1 4组研究对象外周血MDSC、Treg比例的比较（%，±s）

表1 4组研究对象外周血MDSC、Treg比例的比较（%，±s）

注：a与直肠癌组比较，P＜0.05；b与直肠绒毛状腺瘤组比较，P＜0.05；c与直肠增生型息肉组比较，P＜0.05

MDSC比例Treg比例组别

2.2 不同性别、年龄研究对象MDSC比例的比较

不同性别、年龄患者MDSC比例的比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同性别、年龄研究对象的MDSC比例（%，±s）

表2 不同性别、年龄研究对象的MDSC比例（%，±s）

特征性别男女4.13±0.92 4.38±1.15 2.68±0.33 2.79±0.45 1.41±0.12 1.62±0.25 0.86±0.15 0.67±0.08年龄（岁）≤60＞60 4.41±1.22 4.09±0.81 2.54±0.28 2.85±0.56 1.59±0.21 1.48±0.17 0.82±0.13 0.73±0.11直肠癌组（n=58）直肠绒毛状腺瘤组（n=52）直肠增生型息肉组（n=45）健康对照组（n=40）

2.3 T淋巴细胞亚群比例的比较

4组患者CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。进一步两两比较，直肠癌组CD8+T淋巴细胞比例最高，直肠绒毛状腺瘤组、直肠增生型息肉组及健康对照组依次下降；直肠癌组CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值最低，直肠绒毛状腺瘤组、直肠增生型息肉组及健康对照组依次升高，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表3）

2.4 外周血MDSC比例与Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的关系

Pearson相关分析结果提示，外周血MDSC比例与Treg比例呈正相关（r=0.887，P﹤0.05），而与CD4+/CD8+T淋巴细胞比值呈负相关（r=-0.793，P﹤0.05）。

表3 4组研究对象T淋巴细胞亚群比例的比较（±s）

表3 4组研究对象T淋巴细胞亚群比例的比较（±s）

注：a与直肠癌组比较，P＜0.05；b与直肠绒毛状腺瘤组比较，P＜0.05；c与直肠增生型息肉组比较，P＜0.05

组别CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+

3 讨论

MDSC是由粒细胞、单核/巨噬细胞和处于早期分化阶段的髓系前体细胞组成的异质性并具有分化潜能的细胞群。这些未成熟的髓细胞，可以通过多种途径抑制机体的获得性和天然抗肿瘤免疫，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和攻击，促进肿瘤进展。在肿瘤源性因子的诱导下，骨髓中的这些未成熟的前体细胞可迁移至肝脏、淋巴器官及外周血，并大量扩增、分化、成熟，抑制机体的肿瘤免疫[5]。至今为止尚未确定人类MDSC的分子标志，在不同组织来源或同一组织来源、不同部位的肿瘤患者中，MDSC可能不尽相同。HLA-DR-CD33+CD11b+是当前研究中报道较多的谱系标志[6]。MDSC介导免疫抑制的机制可能为通过产生精氨酸酶和诱导型一氧化氮合成酶，产生大量的活性氧以及分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等[1]。

近年来，人们发现了一类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞，将其命名为Treg，可抑制自身反应性T淋巴细胞的活化，进而抑制其免疫效应，维持自身免疫耐受的状态。Treg数量和功能的异常与机体的肿瘤免疫密切相关。肿瘤患者肿瘤组织以及外周血中Treg比例增加与肿瘤患者免疫功能低下有关。Treg比例增加时，其免疫抑制功能增强，使机体处于一种高度免疫耐受的状态，从而为肿瘤的发生、发展提供了免疫逃逸的环境。已有研究发现，肿瘤患者中Treg细胞数量和比例增多[7]，提示机体正处于潜在的免疫抑制状态。外周血中成熟的T淋巴细胞是机体免疫系统中功能最重要的细胞群，可分为CD4+和CD8+两个亚群，在维持机体正常的免疫功能中发挥重要作用。研究表明，T淋巴细胞亚群的变化与肿瘤的发生、发展有密切关系[8]。肿瘤患者的T淋巴细胞亚群发生明显变化，即CD4+T淋巴细胞减少，而CD8+T淋巴细胞增加，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值下降；且随着肿瘤的进展，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值进一步下降，并可能出现倒置。

直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，早期发现是提高治愈率和生存率的关键。积极发现和治疗癌前病变，可阻断癌变进程，预防直肠癌的发生。许多研究表明，大多数直肠癌是由腺瘤恶变而来的，即腺瘤—腺癌演变过程。目前已公认直肠腺瘤是一种癌前病变，且认为腺瘤癌变与腺瘤类型、瘤体大小和组织学类型有关。国内外尚未有直肠癌及癌前病变患者MDSC的研究报道，本研究首次就这一领域进行探讨。本研究结果显示，与健康体检者相比，直肠增生型息肉、直肠绒毛状腺瘤、直肠癌患者外周血中MDSC比例均明显增加；MDSC比例与性别、年龄无关；与健康体检者相比，直肠增生性息肉、直肠绒毛状腺瘤、直肠癌患者外周血中的Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值亦有明显变化，且Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的变化与MDSC比例的变化具有相关性。结果提示，在直肠腺瘤—直肠腺癌的发生演变过程中，MDSC可能通过诱导Treg产生及CD4+、CD8+T淋巴细胞比例变化来抑制机体的细胞免疫功能，进而引起肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤的发生发展。

综上所述，本研究提示MDSC可能通过调控Treg及CD4+/CD8+T淋巴细胞比例来抑制机体的细胞免疫功能，诱导肿瘤免疫逃逸，最终导致“直肠腺瘤—直肠腺癌”的演变过程。因此，在直肠癌的防治及综合治疗时，可以考虑联合靶向MDSC疗法[9-10]，以提高治疗效果，改善患者的预后。

参考文献

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