c-Myb和PCNA在甲状腺乳头状癌患者中的表达及与颈部淋巴结转移的关系

张寅，刘军，苏磊，桑剑锋，姚永忠

南京大学医学院附属南京鼓楼医院甲乳外科，南京 210008

甲状腺癌作为一种常见的甲状腺恶性肿瘤，目 前其发病率正以每年6.2%的速度递增，临床上甲状腺癌按照组织形态分为四类，分别是甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、甲状腺未分化癌以及甲状腺髓样癌[1-3]。其中，甲状腺乳头状癌占甲状腺癌的80%～85%，尽管其预后较好，但患者早期常会出现淋巴结转移。c-Myb是一种核内蛋白质类原癌基因，对造血细胞的分化和增殖具有极其重要的作用，研究发现其在肺癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤细胞中也有表达。Lee等[4]研究认为c-Myb高表达可以促进蛋白质以及相关细胞器的合成，从而达到缩短细胞增殖周期的目的。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作为评估肿瘤恶性潜能的指标，存在于细胞核中，研究表明，其在很多肿瘤组织中都呈现高表达状态，因此，在肿瘤的临床诊断治疗过程中检测c-Myb和PCNA的表达具有重要的参考价值[5]。本研究采用免疫组织化学方法检测c-Myb和PCNA在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中的表达情况，并且对c-Myb和PCNA在甲状腺乳头状癌中的表达与颈部淋巴结转移之间的关系进行分析，从而为临床治疗甲状腺乳头状癌和判断淋巴结转移情况提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年12月至2015年12月于南京大学医学院附属南京鼓楼医院甲乳外科行手术治疗的108例甲状腺肿瘤患者的石蜡标本，包括60例甲状腺乳头状癌石蜡标本、24例甲状腺腺瘤石蜡标本和24例结节性甲状腺肿石蜡标本。所有患者的临床资料完整；患者术前均未接受过任何化疗、放疗；患者均经术后病理学检查确诊；后续切片HE染色和病理学诊断均无误。所有标本均采用10%的中性福尔马林固定液固定，然后切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，苏木素染色，盐酸酒精分化，伊红复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，制备成HE染色切片，行常规的病理学检测诊断无误。甲状腺乳头状癌患者中，男14例，女46例；年龄21～70岁，平均（42.5±5.1）岁；淋巴结转移情况：转移33例，未转移27例；采用2010年版美国癌症联合委员会的TNM分期标准[6]进行分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期20例。甲状腺腺瘤患者中，男10例，女14例；年龄23～60岁，平均（42.5±3.8）岁。结节性甲状腺肿患者中，男8例，女16例；年龄33～66岁，平均（42.1±5.1）岁。3组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 抗体和试剂

鼠抗人c-Myb和PCNA单克隆抗体购于天津北洋百川生物技术有限公司。氯化钠、磷酸氢二钠等试剂购于北京百灵威有限公司。

1.3 免疫组织化学检测方法

将石蜡进行切片，放入40%的酒精中，40℃水浴4 min，进行展开，然后置于60℃烘箱中进行烘片。采用二甲苯脱蜡20 min，然后采用梯度酒精进行水化，对c-Myb蛋白进行高温高压组织修复，对PCNA进行EDTA高温修复，然后加入3%的双氧水，室温静置10 min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性。磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗，加入5%的羊血孵育30 min，除去封闭液，加入一抗，置于4℃冰箱过夜，次日取出，使用PBS冲洗，加入二氨基联苯胺（DAB）显色剂，使用PBS冲洗，终止显色，使用蒸馏水冲洗，盐酸酒精分化，酒精脱水干燥，镜下观察。

1.4 免疫组化判断标准

免疫组化染色结果表现为细胞内出现棕黄色颗粒。其中，c-Myb阳性表达于细胞质，PCNA阳性表达于细胞核。根据染色强度评分：阴性为0分，弱阳性为1分，阳性为2分；依据阳性细胞数所占比例评分：无阳性细胞为0分；1%～25%的阳性细胞为1分；﹥25%的阳性细胞为2分。评分标准：总分为两项评分相加；总分﹥2分为阳性，≤2分为阴性[7-8]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同类型甲状腺肿瘤组织中c-Myb和PCNA表达情况的比较

甲状腺乳头状癌组织中c-Myb的阳性表达率高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿，甲状腺腺瘤组织中c-Myb的阳性表达率高于结节性甲状腺肿，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。甲状腺乳头状癌组织中PCNA的阳性表达率明显高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿，差异均有统计学意义（P﹤0.01）；甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织中PCNA的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同类型甲状腺肿瘤组织中c-Myb和PCNA的表达情况[n（%）]

2.2 不同临床特征甲状腺乳头状癌患者c-Myb和PCNA表达情况的比较

c-Myb在甲状腺乳头状癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、包膜是否完整及淋巴结转移情况无关（P﹥0.05）；PCNA在甲状腺乳头状癌组织中的表达仅与患者的年龄和淋巴结转移情况有关（P﹤0.05）。（表2）

3 讨论

影响甲状腺乳头状癌的因素有很多，包括肿瘤直径、分化程度以及是否浸润血管等[9-10]。对于甲状腺乳头状癌治疗失败的主要原因是肿瘤细胞发生了侵袭与转移。肿瘤细胞的基本特征是细胞失控性的生长，包括细胞凋亡减少、增殖加快以及去分化等多个细胞生命活动[11]。因此，无论是恶性肿瘤还是良性肿瘤，都会表现出异常的增殖。研究表明，当肿瘤直径﹤2 cm时，肿瘤生长较慢，原发性肿瘤只发生局部的侵袭，但未出现转移，这就是所谓的潜伏期[12-14]。但是，当肿瘤直径超过2 cm时，微血管开始形成，瘤体迅速增大，并且发生转移。一旦发生转移，就会给临床治疗带来困难，所以，及早发现并控制肿瘤细胞的转移一直是医学界不断探索的热点和需要攻克的难点[15-16]。有文献报道称c-Myb是一种参与到细胞增殖和分化的核转录因子，是与V-myb同源的原癌基因[17]。其异常表达常见于非造血系统的肿瘤组织中，如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等，已有研究证明其与白血病的发展以及乳腺癌的扩散关系密切[18]。近期研究表明，c-Myb表达很弱或者无表达则表明细胞处于静止状态，但当c-Myb表达明显增加时，则表明细胞处于增殖状态[19]。本研究通过检测c-Myb在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤以及结节性甲状腺肿中的表达情况发现，甲状腺乳头状癌组织中c-Myb的阳性表达率高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿，甲状腺腺瘤组织中c-Myb的阳性表达率高于结节性甲状腺肿，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。提示c-Myb表达水平的高低在一定程度上可以反映甲状腺癌的发生、发展情况，其具体机制尚需进一步深入研究。而c-Myb的表达与甲状腺乳头状癌患者的临床特征无关（P﹥0.05），这一结果与胡啸玲等[20]的研究结果相似，其通过对结肠癌组织中c-Myb表达的检测，发现c-Myb的阳性表达与结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位和肿瘤直径均无关（P﹥0.05）。Trendell-Smith等[21]报道，PCNA在恶性肿瘤中的表达水平高于良性肿瘤，因此，可以将PCNA作为一种判断肿瘤良性或者恶性的指标。张正春等[22]研究表明PCNA蛋白的表达与甲状腺肿瘤的恶性行为有关，发生淋巴结转移患者的PCNA蛋白的阳性表达率高于未发生淋巴结转移患者。本研究通过免疫组织化学法检测PCNA蛋白的表达，结果显示，甲状腺乳头状癌组织中PCNA的阳性表达率明显高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿，差异有统计学意义（P﹤0.01）；但甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织中PCNA的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），提示PCNA的表达与甲状腺肿瘤的恶性行为有关。而从PCNA的表达与患者临床特征的关系来看，PCNA的表达与患者的年龄、淋巴结转移情况有关（P﹤0.05），提示PCNA和甲状腺癌的侵袭、转移以及预后具有紧密的联系。

综上所述，c-Myb和PCNA在甲状腺癌的发生、发展过程中发挥极其重要的作用，可以将其作为一项新的检测指标应用于甲状腺肿瘤的临床诊断中。但是，c-Myb的作用机制仍需进一步深入探讨，一旦其作为一种新的治疗靶点被发掘出来，将会极大地推动甲状腺肿瘤治疗方式的发展。目前，国内对于PCNA的研究仅仅局限于病理学现象的观察，如何将疾病的发生和PCNA的基础研究相结合，寻找以PCNA为突破口的治疗方法将是未来治疗甲状腺肿瘤又一个努力的方向。

表2 不同临床特征甲状腺乳头状癌患者c-Myb和PCNA表达情况的比较

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