miRNA-214在甲状腺乳头状癌患者血清中的表达水平及临床意义

郭辉，张斌，胡利民

天门市第一人民医院普外科，湖北 天门 431700

甲状腺癌是一种常见的内分泌系统恶性肿瘤， 发病率居所有恶性肿瘤的第6位[1]。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌中最常见的一种组织学类型，PTC属于高分化惰性肿瘤，大多数预后良好，但仍有部分患者出现淋巴结转移或被膜侵犯，影响手术切除率及患者预后。因此，开展PTC相关分子生物学研究，寻找可评估PTC侵袭性、指导术式及评价预后的分子标志物至关重要。研究显示，除基因重排与突变外，微小RNA（miRNA）也参与PTC的发生和发展[2]。miRNA是一种高度保守的非编码单链小分子RNA，参与细胞增殖、分化及凋亡等过程[3]。由miRNA介导的基因转录后调控是一种重要的基因表达调控方式，miRNA突变或异常在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中发挥关键作用[4]，且与肿瘤的治疗反应、分期、预后及复发检测密切相关[5]。miRNA-214作为miRNA家族成员之一，具有类似癌基因或抑癌基因的功能。研究证实，miRNA-214表达异常与乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡过程密切相关，可作为肿瘤诊断、治疗及预后评估的分子标志物[6]。外周血miRNA具有良好的稳定性，miRNA检测具有灵敏、便捷等优势，成为近年来肿瘤分子生物学的研究热点[7]。本研究采用实时荧光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测PTC及良性甲状腺肿瘤患者的血清miRNA-214表达水平，分析其与PTC患者临床特征的关系，旨在探讨其在PTC诊断及个体化评估中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年1月至2017年6月天门市第一人民医院收治的经术后病理检查确诊的50例PTC患者和46例良性甲状腺肿瘤患者的临床资料。所有患者均排除其他恶性肿瘤史，术前均未接受抗肿瘤治疗。PTC患者中，男20例，女30例；年龄24～63岁，平均（43±12）岁；甲状腺肿瘤患者中，男14例，女32例；年龄25～71岁，平均（45±14）岁；结节性甲状腺肿31例，甲状腺腺瘤15例。两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清采集与保存 采集患者的清晨空腹外周静脉血4 ml，置于真空血样采集管中，室温静置30～60 min，3500 r/min离心 10 min，收集上层血清于无酶EP管中，保存于-80℃医用低温箱。

1.2.2 血清总RNA提取 采用QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit抽提和纯化标本中的总RNA，具体操作严格按照说明书进行。采用分光光度计检测提取的总RNA纯度及浓度，取A260/A280为1.8～2.1的样本，置于-80℃医用低温箱保存用于后续试验。

1.2.3 逆转录 采用QIAGEN公司的miScriptⅡRT Kit将RNA逆转录成cDNA，反应体系（20 μl）：5×miScript HisSpec Buffer 4 μl，10×miScript Nucleics Mix 2 μl，RNase-free water 6 μl，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl，RNA 6 μl。反应条件：37℃、60 min，95℃、5 min。将逆转录反应液用RNase-free water稀释11倍后进行分装，置于-20℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增 采用QIAGEN公司的miScript SYBR® Green PCR Kit和miScript Primer Assays对cDNA模板进行PCR扩增。miRNA-214及内参Ce_miR-39_1的特异性引物均为QIAGEN公司专利产品（Assay name:Hs_miR-214_2）。反应体系（20 μl）：2 × QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10×miScript Precursor Assay 2 μl，RNasefree water 6 μl，模板 cDNA 2 μl。反应条件：95 ℃、15 min（预变性），94℃、15 （s变性），55℃、30 （s退火），共40个循环；70℃、30 （s延伸）。每个样本设置两个复孔，每批样本设置1个空白对照。

1.2.5 miRNA-214相对表达量的计算 采用2-△△Ct法计算miRNA-214的相对表达量，以Ce_miR-39_1为内参。每个标本的Ct值取复孔均值，△Ct=C（tmiRNA-214）－C（tCe_miR-39_1），△△Ct=△Ct试验组－△Ct对照组，miRNA-214的相对表达量为2-△△Ct。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0和Medcalc 15.2.2软件对-数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）或中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Mann-Whitney U检验分析miRNA-214表达水平与PTC患者临床特征的关系。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线），分析miRNA-214对PTC的诊断效能。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC患者和良性甲状腺肿瘤患者血清miRNA-214表达水平的比较

PTC患者的血清miRNA-214表达水平为3.798（1.856，5.094），明显高于良性甲状腺肿瘤患者的 1.272（0.711，2.351），差异有统计学意义（Z=-2.941，P=0.003）。

2.2 血清miRNA-214表达水平与PTC患者临床特征的关系

血清miRNA-214表达水平与PTC患者的肿瘤最大径、被膜侵犯情况、淋巴结转移情况及TNM分期有关（P﹤0.05），与患者的性别、年龄无关（P﹥0.05）。（表1）

表1 血清miRNA-214表达水平与PTC患者临床特征的关系

2.3 血清miRNA-214对PTC的诊断价值

以术后病理结果为金标准绘制ROC曲线，血清miRNA-214诊断PTC的曲线下面积（area under curve，AUC）为 0.762（Z=5.328，P﹤0.01，95%CI：0.664～0.843）。当Youden指数为0.478时，cut off值为3.778，灵敏度为50.00%，特异度为97.83%。（图1）

图1 血清miRNA-214诊断PTC的ROC曲线

2.4 血清miRNA-214对PTC侵袭、转移的诊断价值

以术后病理结果为金标准绘制ROC曲线，血清miRNA-214诊断PTC淋巴结转移的AUC为0.825（Z=4.228，P﹤0.01，95%CI：0.692～0.918），当Youden指数为0.639时，cut off值为4.865，灵敏度为81.82%，特异度为82.05%。血清miRNA-214诊断 PTC 被膜侵犯的 AUC 为 0.757（Z=3.649，P﹤0.01，95%CI：0.615～0.867），当Youden指数为0.427时，cut off值为4.103，灵敏度为75.00%，特异度为67.65%。（图 2、图 3）

3 讨论

图2 血清miRNA-214诊断PTC淋巴结转移的ROC曲线

图3 血清miRNA-214诊断PTC被膜侵犯的ROC曲线

miRNA是广泛存在于动植物体内，长约22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，能以碱基互补的形式特异性结合mRNA，抑制靶mRNA的转录和翻译，或直接降解靶mRNA，在转录后水平对基因表达进行负性调控，从而参与细胞的增殖、分化及凋亡。miRNA-214是miRNA家族的重要成员，位于染色体1q24.3区域和发动蛋白超家族成员DNM3第14号内含子上。miRNA-214为多功能miRNA，研究表明，miRNA-214在不同肿瘤中的表达水平不同，可通过调控癌基因及抑癌基因的表达水平，从而在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中发挥重要作用[8]。外周血miRNA为最小的非侵入性分子标志物，组织中的miRNA可经主动分泌或被动渗漏等途径进入外周血。外周血miRNA具有良好的抗RNase活性[9]，且受内源性RNA酶保护而免于降解[10]，具有较好的稳定性和特异性，能稳定存在于血清、唾液及尿液等体液中[11]。通过现代技术可在体液中检测到病理状态下异常表达的miRNA，这使得外周血miRNA成为潜在的无创性诊断、治疗及预后评估的新型分子生物学标志物。目前，血清miRNA-214已被证实可作为乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等的特异性肿瘤标志物而应用于临床[12]。

关于miRNA-214在恶性肿瘤中的表达水平，近年来有大量的研究。Wang等[13]研究发现，miRNA-214在肝癌组织中表达下调，认为miRNA-214在肝癌的发生、发展、侵袭及转移过程中起重要作用。Schwarzenbach等[14]研究报道，乳腺癌患者的外周血miRNA-214表达水平上调，miRNA-214在评价恶性指标及淋巴结转移扩散方面具有重要作用。Yang等[15]研究显示，miRNA-214在胃癌组织及细胞中均高表达，并证明miRNA-214通过绑定PTEN的3’UTR靶点，负性调控基因转录后水平，从而调节胃癌细胞的扩散、迁移和侵袭。另有研究表明，miRNA-214在食管癌中的表达下调，miRNA-214高表达能抑制食管癌细胞的增殖、转移及凋亡，敲除miRNA-214后可促进肿瘤的发生及发展，并由此认为miRNA-214是食管癌的抑癌基因[16]。

本研究通过qRT-PCR检测PTC及良性甲状腺肿瘤患者的血清miRNA-214表达水平，结果发现，PTC患者的血清miRNA-214表达水平明显高于良性甲状腺肿瘤患者（P﹤0.01），ROC曲线分析证实miRNA-214可作为区分PTC与良性甲状腺肿瘤的潜在分子标志物，对诊断PTC具有一定的临床价值。本研究还发现，miRNA-214表达水平与PTC患者的肿瘤最大径、被膜侵犯情况、淋巴结转移情况及TNM分期有关，即肿瘤越大、存在被膜侵犯及淋巴结转移、TNM分期越晚，miRNA-214表达水平越高，提示miRNA-214在PTC的发生、发展、侵袭及转移过程中发挥重要作用。关于其他miRNA家族成员在PTC中的表达，Lee等[17]研究报道，PTC患者血浆中miRNA-155的表达较甲状腺良性结节患者或健康人群明显上调，其表达水平与PTC的侵袭性及预后不良有关。Yang等[18]研究显示，miRNA-222-3p在PTC组织中表达升高，且其表达量与存在被膜侵犯、TNM分期晚、存在淋巴结转移等病理因素密切相关，并认为miRNA-222-3p表达异常是PTC发生、发展、侵袭及转移的重要因素。因此，miRNA-214可作为辅助诊断PTC的新的生物学标志物，并可用于术前临床评估，通过调节miRNA-214的表达可以抑制肿瘤的侵袭及转移，为肿瘤治疗提供了新思路。

尽管PTC在生物学行为上表现为高分化惰性肿瘤，具有相对较弱的侵袭性和转移性，肿瘤进展慢，病死率低，但PTC常发生淋巴结转移，且早期发生颈部淋巴结转移的可能性较大，从而表现出高侵袭性，影响预后。因此，术前了解PTC的侵袭性等病理学特征对指导术式、术后治疗及预后评估十分重要。在miRNA与PTC生物学行为关系的研究中，Yip等[19]认为，在合并局部复发或远处转移的侵袭性PTC患者中，miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p的表达水平较非侵袭性PTC患者明显上调；另外一项研究也显示，miRNA-221-3p、miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p在伴有被膜侵犯的PTC组织中高表达[20]。其他研究则认为，血清miRNA-222-3p、miRNA-146b-3p、miRNA-221-3p和miRNA-222-3p在合并有淋巴结转移的PTC患者中表达水平更高[17,21]。本研究结果显示，血清miRNA-214表达水平与淋巴结转移情况及被膜侵犯情况有关，且ROC曲线表明，miRNA-214在评价PTC是否合并淋巴结转移或被膜侵犯方面具有诊断价值，说明术前检测miRNA-214表达水平能预测PTC的某些病理特征及生物学行为，对术前PTC患者的个体化病情评估具有重要的指导意义。

综上所述，miRNA-214在PTC患者的血清中表达上调，其表达水平能反映PTC的进展情况，可作为术前评估PTC淋巴结转移及被膜侵犯情况的一项辅助指标，并对PTC的临床诊断具有一定价值。笔者后续将研究miRNA-214在PTC组织中的表达水平，以探究miRNA-214在PTC发生、发展、侵袭及转移中的具体作用机制，为miRNA-214作为新的诊断、治疗及预后评估指标提供依据。

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