紧密连接相关蛋白在肺癌脑转移瘤中的表达及临床意义

鄢少聪，应学明

景德镇市第一人民医院肿瘤科，江西 景德镇 333000

约10%的成人恶性肿瘤患者出现有症状的脑转移，且该比例仍在上升[1-2]。肺癌是中国目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均呈逐年上升趋势，而脑部转移是导致肺癌患者治疗失败和死亡的常见原因[3-4]。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）对维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要意义[5-6]，跨膜蛋白claudin 5、occludin及胞质附着蛋白ZO-1是BBB紧密连接的主要组成部分，其表达水平的降低或缺失可能与脑转移瘤的发生密切相关。本研究采用免疫组织化学法检测肺癌脑转移瘤组织和正常脑组织中claudin 5、occludin及ZO-1的表达情况，旨在探讨其与患者临床特征的关系[7-8]，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2008年1月至2014年6月景德镇市第一人民医院神经外科收治的63例肺癌脑转移瘤患者的术后存档石蜡标本为转移组。所有患者均经病理组织学检查确诊为肺癌脑转移瘤，且术前均未接受化疗或放疗。63例肺癌脑转移瘤患者中，腺癌25例，鳞癌14例，小细胞癌22例，腺鳞癌2例；年龄43～71岁，中位年龄57岁。另外，收集同期于本院行颞叶切除术的28例癫痫患者的术后正常脑组织石蜡标本为对照组。两组患者的性别、年龄等资料比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性，详见表1。

1.2 主要试剂

兔抗claudin 5（1∶100，ab15106）、occludin（1∶100，ab31721）抗体及羊抗ZO-1（1∶200，ab190085）抗体购自英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔、鼠抗山羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB试剂盒、Envision试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

表1 两组患者的基本临床特征[n（%）]

1.3 实验方法

蜡块采用连续切片，厚度3 μm，按照Envision试剂盒说明书的步骤进行免疫组化染色；每种蛋白染色均设立转移组及对照组，以磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作为阴性对照，以预实验反复多次证实均呈阳性的肺癌脑转移瘤组织切片作为阳性对照。

1.4 结果判断

显微镜下每张切片随机选取5个高倍镜视野，判定染色强度和阳性细胞百分比。染色强度：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占百分比：0～19%为0分，20%～39%为1分，40%～59%为2分，≥60%为3分。免疫组化染色结果由两位资深病理学专家共同进行评定，以两项评分之积为最终得分，并定义如下：0～4分为低表达，5～9分为高表达。

1.5 生存随访

从术后病理诊断为肺癌脑转移瘤之日开始，利用记录在案的电话，对63例患者进行随访，随访截至患者死亡、失访或2015年12月31日，中位随访时间为18个月，其中4例患者失访。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 claudin 5、occludin及ZO-1表达率的比较

免疫组化染色结果显示：claudin 5、occludin、ZO-1阳性表达信号为棕黄色颗粒，均主要定位于脑毛细血管内皮细胞的细胞膜上，另可见少数星型胶质细胞着色，详见图1。claudin 5、occludin、ZO-1在正常脑组织中的高表达率分别为50.0%、57.1%、75.0%，均高于肺癌脑转移瘤组织的25.4%、34.9%、33.3%，差异均有统计学意义（P﹤0.05），详见表2。

图1 claudin 5、occludin、ZO-1在不同组织中的表达情况（Envision法，×400）

2.2 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表达与肺癌脑转移瘤患者临床特征的关系

claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表达与肺癌脑转移瘤患者的年龄、病灶个数有关（P﹤0.05），其中≥60岁、病灶单发患者脑转移瘤组织中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的高表达率均分别高于﹤60岁、病灶多发的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。不同性别、肿瘤直径、病理类型患者脑转移瘤组织中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表达情况比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表3）

2.3 肺癌脑转移瘤组织中claudin 5、occludin及ZO-1的相关性

Spearman相关分析结果显示：肺癌脑转移瘤组织中claudin 5与occludin的表达呈正相关（r=0.338，P=0.007）；claudin 5与ZO-1的表达呈正相关（r=0.284，P=0.024）；occludin与ZO-1的表达呈正相关（r=0.259，P=0.040）。

表2 不同组织中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表达情况的比较[n（%）]

表3 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表达与肺癌脑转移瘤患者临床特征的关系[n（%）]

2.4 claudin 5、occludin、ZO-1低表达组与高表达组肺癌脑转移瘤患者的生存情况比较

63例肺癌脑转移瘤患者中，claudin 5低表达与高表达患者的中位总生存期分别为6.3个月和8.2个月，差异有统计学意义（χ2=8.43，P﹤0.01）；occludin低表达与高表达患者的中位总生存期分别为5.0个月和8.2个月，差异有统计学意义（χ2=10.26，P﹤0.01）；ZO-1低表达与高表达患者的中位总生存期分别为6.3个月和7.8个月，差异有统计学意义（χ2=7.70，P﹤0.01）。（图2～图4）

3 讨论

BBB是由无窗孔的毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接（tight junction，TJ）、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个复合体[9]，毛细血管内皮细胞及其间的TJ是该复合体的主要结构基础，参与调节细胞物质转运、维持上皮极性、细胞增殖分化、肿瘤细胞转移等重要过程[10]，是血脑间物质交换的第一道屏障，也是肿瘤细胞扩散进入脑部的必经之路。

图4 ZO-1高表达组与低表达组的生存曲线图

Claudin是TJ的主要构成成分，通过ZO-1连接于肌动蛋白细胞骨架[11-12]，是决定BBB通透性的关键因素[13]。在脑微血管循环内皮系统中，claudin 5表达丰富，有研究认为claudin 5是构成BBB的主要跨膜蛋白[14-15]。occludin是紧密连接的主要结构蛋白，是第一个被分离出来的完整的膜蛋白[16]。相关研究显示，occludin在脑组织血管内皮的表达明显高于非神经组织的血管内皮，这也是BBB通透性明显低于其他血屏障的重要原因[17-18]。ZO-1通过与其同源异构体ZO-2、ZO-3形成复合体，为TJ的多种跨膜蛋白及胞质蛋白搭建脚手架样平台[19]，多数情况下，只要ZO-1受到破坏，TJ的功能也会随之发生变化，因此，ZO-1常被作为评估机体内各种组织TJ屏障功能和通透性功能的指标[20-21]。紧密连接结构与功能的变化是多种神经系统疾病病理、生理变化的核心过程。

本研究结果显示，claudin 5、occludin、ZO-1在肺癌脑转移瘤组织中的高表达率均较正常脑组织降低，提示3种蛋白的表达减少可能与肺癌脑转移瘤的发生有关。研究显示，claudin 5、occludin、ZO-1在多种肿瘤组织中表达异常，如在胰腺癌的进展中，occludin表达下调与肿瘤细胞的侵袭性有着密切关系[22]。Ni等[23]的研究显示，NSCLC组织中，ZO-1高表达率低于癌旁组织（66.35%vs 83.51%，P﹤0.05），且ZO-1 mRNA的表达水平也低于癌旁组织（0.951±0.556 vs 1.752±1.094，P﹤0.05）。但 Paschoud等[24]研究发现，在肺腺癌中能检测到claudin 5、occludin、ZO-1的表达，而在鳞癌中只能检测到ZO-1表达，提示不同的紧密连接蛋白可能经不同的通路参与肺癌的发生、发展。在对胃癌的研究中，发现幽门螺杆菌引起胃癌的一种可能机制是通过激活MLC激酶使MLC磷酸化，破坏claudin 5，进而引起胃上皮细胞的旁渗透增加[25]。另外，occludin、ZO-1表达下降可引起肠道菌群异位，导致胃癌恶病质的发生[26]。Wu等[27]发现在乳腺癌脑转移瘤发生过程中，基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP1）通过降低 claudin、occludin的表达，使BBB的屏障功能减弱。MMP抑制药可阻止TJ的退化，减弱BBB的破坏，可作为脑转移瘤治疗的一个方向[28]。

本研究发现claudin 5、occludin、ZO-1的异常表达与患者的年龄、病灶个数有关，其中﹤60岁组患者3种蛋白的高表达率低于≥60岁组患者，病灶个数越多的患者，claudin 5、occludin、ZO-1的高表达率越低。在食管癌中，claudin 5在无淋巴结转移组中的表达水平高于有淋巴结转移组[29]，国内学者汪渊等[30]研究发现，occludin、ZO-1的异常表达与食管鳞癌的肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关，随着分化程度降低，蛋白表达逐渐减少，且无淋巴结转移组的蛋白阳性表达率高于有淋巴结转移组。Ohtani等[31]则发现，紧密连接蛋白occludin、ZO-1与胃癌细胞的侵袭性相关。但在交界性恶性卵巢肿瘤中，有研究发现，CA125、TATI的表达水平与claudin 5呈正相关，且腹腔积液的发生率与claudin 5的表达水平有关[32]。脑转移瘤好发于45～60岁人群，男性多于女性，70%～80%属于多发。本研究中，3种蛋白在﹤60岁组及多发者中高表达率低，但在性别方面的表达水平比较，差异无统计学意义，由此说明，claudin 5、occludin、ZO-1的表达水平与脑转移瘤的流行病学特点大致相符。

另外，本研究还发现，肺癌脑转移瘤患者中，claudin 5、occludin、ZO-1高表达患者的中位生存时间更长，差异有统计学意义（P﹤0.01）。而Nissi等[32]的研究也得出类似的结果，ZO-1高表达组肺癌患者的5年生存率较低或无表达组患者高（P﹤0.001）。这意味着claudin 5、occludin、ZO-1可能是与肺癌脑转移瘤患者生存期密切相关的指标，但是否能作为临床预后的决定性因素，还需要进一步研究。

目前，有关紧密连接蛋白与各种肿瘤发生关系的研究十分热门，而紧密连接蛋白与BBB的关系也很密切，但有关claudin 5、occludin、ZO-1与肺癌脑转移瘤关系的实验研究却鲜有报道。综上所述，脑血管内皮细胞间的紧密连接蛋白claudin 5、occludin、ZO-1表达减少或缺失，使BBB的结构功能受到破坏，为肿瘤细胞的侵袭、转移提供了可能，是肺癌脑转移瘤发生的可能机制，但仍有待更深入的研究证实。

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