肝细胞癌侧群/非侧群细胞中miRNA-21表达差异的检测△

吕洋，杨珮珮，叶龙，赵平，姜经航

荆门市第二人民医院普外科，湖北 荆门 448000

目前肿瘤切除手术仍然是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最主要的治疗方案之一，但术后复发率高，导致患者的生存率低，预后差。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）与肿瘤的发生和发展密切相关，可以增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，促进肿瘤的复发和转移，因此针对CSC进行的靶向治疗可能为肿瘤治疗的新方向。近年来，有研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡可影响HCC的复发、转移和预后[1]。有报道指出，miRNA-21可以促进肿瘤细胞增殖和凋亡，并且与多种肿瘤有关，miRNA-21表达上调的患者术后无瘤生存时间缩短，预后差[2]。本研究通过检测MHCC-97H细胞中侧群（side population，SP）细胞和非侧群（nonside population，NSP）细胞的miRNA-21含量，分析其与CSC的关系，为进一步探讨miRNA-21表达与HCC干细胞的关系提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝细胞癌的MHCC-97H细胞系购自复旦大学肝病研究所。Hoechst33342、维拉帕米（verapamil）和7-AAD购自Sigma公司（美国），高糖DMEM培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），FACSC Salibur流式细胞仪购自BD公司（美国），Trizol试剂购自Invitrogen公司（美国），SYBR®Premix和逆转录试剂盒购自Takara公司（日本），荧光定量PCR仪ABI7300购自ABI公司（美国）。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养 将HCC的MHCC-97H细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 SP细胞检测与分选 将处于对数期的肿瘤细胞消化、计数后调整细胞密度为1×106/ml，分为实验组和对照组。对照组：加入Hoechst33342染料前15 min，细胞悬液中加入verapamil，调整verapamil浓度为50µmol/L。然后实验组和对照组细胞悬液中均加入Hoechst33342染料，并且将Hoechst33342染料浓度调整为5、6、7、8、9、10、11、12 mg/L。将实验组和对照组细胞同时置于37℃恒温水浴箱中孵育90 min，为防止细胞在孵育过程中出现沉降现象，每10 min将装有细胞的试管混匀1次。90 min后用4℃预冷的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤细胞。将洗涤后细胞用含有5%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬，然后加入7-AAD，调节其浓度为1 mg/L。进行流式细胞仪器检验前需将细胞过滤于上样管中，保存于冰上。具体流程可以参照文献[3]。重复3次。

1.2.3 总RNA的提取 选SP、NSP细胞，离心后收集，Trizol法提取总RNA，总RNA的纯度用核酸微量检测仪进行分析检测，总RNA的完整性使用1.0%琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

1.2.4 逆转录去除基因组DNA 参照Taraka试剂说明书提供的逆转录、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）反应体系和条件进行相应的实验。所得cDNA分装并保存于-20℃冰箱中用于后续实验。

1.2.5 RT-PCR 使用Takara公司提供的引物序列，详见表1。以hsa-U6为内参。基因的表达量通过2-△△Ct法确定，△△Ct=（CtSP细胞miRNA-21－CtSP细胞hsa-U6）－（CtNSP细胞miRNA-21－CtNSP细胞hsa-U6）。每个样本均设3个复孔。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP、NSP细胞的识别

经7-AAD染色后去除死细胞和细胞碎片，前向角散射（forward scatter，FSC）信号见图1。通过Hoechst33342红光和蓝光双参数图可以区分SP细胞与NSP细胞，SP细胞具有外排Hoechst33342染料的作用，因此表现为弱染状态，左下角具有2种荧光——预热355 nm波长紫外光，激发Hoechst33342染料，经610 nm双色短通反射滤镜分为两类散射荧光，包括450/30带通下的蓝光部分（Hoechst blue）以及675/20带通下的红光部分（Hoechst red）——均为阴性或很弱的区域。以Hoechst blue为Y轴，Hoechst red为X轴作二维散点图，并设定低Hoechst red及低Hoechst blue且维拉帕米组缺失的区域为SP细胞的“门”，检测并分选SP、NSP细胞，详见图2。

图1 7-AAD标记活细胞（P0）

图2 流式细胞仪分选SP、NSP细胞

2.2 SP细胞的监测与分选

采用不同浓度的Hoechst33342对HCC的MHCC-97H细胞进行染色后，随着染料浓度的增加，检测发现活细胞的数量出现减少趋势，说明染料Hoechst33342可以对活细胞产生一定的毒性，并且随着浓度的增加，毒性亦增加。随之SP细胞数量也减少，但是对照组中仍有SP细胞存在，细胞并未完全染色。对照组SP细胞数量为0时，染色的活细胞比例较高，对应的染料浓度为10 mg/L，此时实验组SP细胞的平均比例为（8.4±0.7）%。（表2）

2.3 总RNA的纯度与完整性

从SP、NSP细胞中提取的总RNA纯度为1.8～2.0，其中没有DNA和蛋白质混杂。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示3条条带清晰，并且每种细胞的总RNA无拖尾条带。（图3）

表2 HCC的MHCC-97H细胞中活细胞与SP细胞的比例（%，±s）

表2 HCC的MHCC-97H细胞中活细胞与SP细胞的比例（%，±s）

Hoechst33342染料浓度（mg/L）5 6 7 8 9 1 0对照组6.8±1.8 1.9±1.1 0.7±0.3 0.4±0.1 0.2±0.1 11 12活细胞实验组98.6±0.9 97.8±1.1 96.4±0.9 94.7±1.3 93.5±0.5 92.4±1.7 88.4±3.4 86.5±2.7对照组97.7±0.2 96.8±0.4 95.3±1.2 92.6±0.8 90.4±2.2 88.1±2.0 79.1±2.5 76.6±4.3 SP细胞实验组44.8±5.7 32.4±4.2 23.3±4.8 12.0±1.9 10.3±2.1 8.4±0.7 6.3±1.4 3.2±0.9 0 0 0

2.4 SP与NSP细胞中miRNA-21的表达情况

以hsa-U6为内参，采用RT-PCR法检测SP细胞中miRNA-21的含量是NSP细胞的（7.30±0.78）倍，差异有统计学意义（P﹤0.05）。

3 讨论

有研究发现，CSC归巢是肿瘤转移的本质，而干细胞龛是干细胞集中存储的地方，具有特定的微环境，严格调节和控制干细胞的正常活动[4]。肿瘤细胞转移时，CSC从原发肿瘤病灶脱离，进入周围血管的血液或者淋巴循环。CSC通过感受趋化因子的浓度梯度，黏附于血管内皮细胞表面，而后穿过微血管管壁，在趋化因子的作用下CSC在转移位点寻找干细胞龛，形成肿瘤转移病灶，完成CSC归巢[5]。因此针对归巢的CSC处理的研究有可能为肿瘤的靶向治疗提供依据，可能提高患者的远期生存率。但CSC缺乏特异性标志物，对其分离、纯化比较困难，因此建立简便且有效的分离方法是研究CSC的首要目标。

自SP细胞从小鼠骨髓造血干细胞中首次被发现以来[6]，越来越多的学者从多种恶性肿瘤细胞中分离出具有一定继续多向分化、无限增殖和自我更新的具有干细胞特性的SP细胞[3,7-8]，表明SP细胞中包含部分CSC。因此，通过SP细胞分选方法富集CSC被认为是一种简便且有效的途径。

ATP结合盒转运体可以将针对细胞核DNA的Hoechst33342染料排除细胞外，在流式细胞系上位于流式标记的双参数图左下角，主要表现为细胞核不染色或染色程度很低；同时其外排能力可以被verapamil抑制，SP细胞比例明显减少，甚至消失。本研究中对照组细胞加入verapamil后，在控制所研究的细胞具有相对活性细胞的前提下，随着Hoechst33342染料浓度的增加，verapamil阻断的细胞中SP标记阳性细胞逐渐减少，将对照组SP标记阳性细胞比例为0时实验组存在的且具有活性的细胞定义为SP细胞。本研究通过流式细胞仪分选出的SP细胞已经被相关研究证实具有HCC干细胞相关特性[9]。

图3 总RNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳结果

有研究表明，miRNA在调控CSC的自我更新和多向分化中发挥着重要的作用，类似癌基因和抑癌基因的作用[10]。因此推测将miRNA作为研究CSC的方向，可能为临床肿瘤治疗提供新的治疗方案。miRNA-21已经证实与多种恶性肿瘤存在一定的关系，miRNA-21高表达可以促进肝癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、转移[2]。有研究表明，在胰腺癌中miRNA-21可以启动CSC，促进CSC转移，增强肿瘤化疗抵抗[11]。

最近有研究发现，多种CSC中miRNA-21表达上调，对CSC的生物学特性有一定的影响[12]。Misawa等[12]从多种肿瘤细胞系中分离出具有CSC特性的SP细胞，基因芯片检测结果显示，SP细胞的miRNA-21表达水平高于NSP细胞，同时SP细胞的克隆形成能力受到抑制及对化疗药物敏感性增强均与miRNA-21表达下调有密切的关系。另外，有研究发现结肠癌干细胞miRNA-21表达上调，并通过抑制PDCD4表达增强干细胞接种于裸鼠后的成瘤能力[13]。同时，miRNA-21过表达可以增加干细胞的生物学特性，促进乳腺癌MCF-7细胞发生上皮-间叶样表型转化，导致肿瘤进一步发展，侵袭、迁移和克隆形成能力明显增强[14]。国内学者Li等[15]通过分析miRNA基因表达谱发现大鼠HCC干细胞中miRNA-21表达也出现上调的情况。本研究中SP细胞的miRNA-21表达水平是NSP细胞的（7.30±0.78）倍，差异有统计学意义（P﹤0.05），可以间接说明miRNA-21表达与HCC干细胞存在某种关系，检测患者HCC组织中干细胞和非干细胞中miRNA-21的表达水平，可以评估患者的肿瘤恶性程度和复发风险，同时对于miRNA-21表达水平高的患者，术后应该密切监测，采取相应的治疗方案，预防肿瘤复发，提高患者的生存率。

综上所述，本研究采用优化Hoechst33342染料浓度的前提下，通过流式细胞仪将SP、NSP细胞从HCC细胞系MHCC-97H中分离，经RT-PCR检测发现SP细胞的miRNA-21表达水平高于NSP细胞，说明miRNA-21表达与HCC干细胞存在一定的关系，但其相应的分子学机制需要后续实验进一步探讨。

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