杨桃果汁对肝组织抗氧化应激及降糖的研究

杨映霞，黄天敏，黄仁彬，徐小惠

（1.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁530021；2.广西医科大学药学院，广西南宁530021）

糖尿病是一种慢性糖脂代谢紊乱的疾病，而肝脏作为糖脂代谢的重要器官，两者关系密不可切。这与肝脏内过量的氧化应激导致胰岛β细胞功能障碍和胰岛素分泌受损有关[1-3]。近年来，2型糖尿病发病率仍在世界各地大幅增加[4]，其损害肝脏组织的问题也越来越得到重视[5]。

杨桃产自热带、亚热带，是被子植物门五敛子属的一种，可治疗消化系统疾病、咳嗽和糖尿病等[6-7]，营养价值高且味道酸甜爽口，易被人群接受。多项研究表明杨桃提取物具有降血糖、改善胰岛细胞凋亡、改善糖尿病肾病的治疗作用以及体外抗氧化的治疗作用[8-11]。本研究进一步探讨杨桃果汁对糖尿病小鼠肝组织抗氧化应激及其降糖作用的影响，以期完善杨桃药理功效，为临床提供合理用药。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SPF 级雄性昆明小鼠，体重（20±2）g，由广西医科大学实验动物中心提供。动物饲养于符合医学实验动物环境设施要求的饲养环境中。饲养环境通风良好，室温18℃～25℃，相对湿度40%～70%，12 h光照昼夜循环。实验动物使用许可证SCXK（桂）2009－0002。

杨桃于2013年6月采自于中国广西灵山县，经过广西中医药研究院赖茂祥教授鉴定，制成含生药浓度为5 kg/L的试液，储存于阴凉干燥环境中备用。

盐酸二甲双胍片（批号：131019）：北京京丰制药有限公司；链脲佐菌素（有效期：201512）：美国sigma公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20140113）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号：20140210）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号：20140114）、糖原测定试剂盒（批号：20140209）：南京建成生物工程研究所；小鼠琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）酶联免疫分析试剂盒（批号：201411）、小鼠环磷酸腺苷酶（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）联免疫分析试剂盒（批号：201411）：北京诚林生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

722型分光光度计：上海精密科学仪器有限责任公司；RE-52旋转式蒸发器、CENTRIFUGE TDL-5型离心机：上海安亭实验仪器有限公司；FORMA 991超低温冰箱：Thermo Fornma公司；LDZ4-0.4自动平衡微型离心机：北京离心机厂；HANGPING JA1003型上皿电子天平：上海天平仪器厂。

1.3 糖尿病模型建立及分组给药

取90只雄性昆明小鼠，造模前禁食12 h，随机抽取10只作为空白组（即正常对照组），其余小鼠分别静脉注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）0.12 g/kg。72 h后采血测定空腹血糖，凡空腹血糖≥11.1mmol/L视为糖尿病动物模型[12]。将造模成功的小鼠随机分配成5个组，即模型对照组、二甲双胍对照组（即阳性对照组 0.32g/kg）、杨桃果汁低、中、高剂量组（5、10、20g/kg），每组10只。每天上午空腹灌胃给药一次，模型对照组用生理盐水灌胃，各组连续灌胃14 d。

1.4 标本的采集

将小鼠取血后处死，立即取其肝脏，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干水分，称重后放至-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.5 观测指标及方法

1.5.1 一般指标及肝糖原测定

观察小鼠的精神活动、毛发改变、饮水量、进食量、大小便等一般状态，并记录体重变化情况、死亡情况等。

取肝组织标本，称重0.5 g，放至室温，加入30%的氢氧化钾溶液1.5mL，煮沸20min，放冷，加入3mL无水乙醇，煮沸，放入离心机内以转速3 500 r/min.离心10min，倾倒上清液，沉淀用蒸馏水溶解移入25mL容量瓶中定容，制成测试液，按蒽酮法进行测定[13]。

1.5.2 肝组织中丙二醛（MDA）和超氧化歧化酶（SOD）测定

取肝组织标本，称重0.5 g，用生理盐水配成10%肝组织液，用高速匀质机制成10%肝组织匀浆，于冷冻离心机3 000 r/min离心15min，取上清液按试剂盒说明书用于肝组织MDA、SOD测定。

1.5.3 肝组织中琥珀酸脱氢酶 （SDH）、环磷酸腺苷（cAMP）的测定

取肝组织标本，按照试剂盒说明书对肝组织SDH、cAMP进行操作和计算。

1.6 胰岛形态学观察

标本常规乙醇逐级脱水，石蜡包埋，病理切片，HE染色，光学显微镜观察并采集图片。

1.7 统计学处理

采用统计学软件SPSS16.0对所有数据进行分析，结果以均数±标准差表示。P＜0.05或 P＜0.01差异显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 杨桃果汁对STZ所致糖尿病小鼠的一般状况及肝糖原的影响

造模前小鼠精神状态好，皮毛光滑，活动自如，饮水量、进食量和大小便正常，造模成功后小鼠精神萎靡，出现多食、多饮和多尿等症状，成模小鼠体重略有下降。灌胃给药后，杨桃果汁中剂量组和高剂量组的小鼠状态有较明显的改善，精神状态良好，体重变化与二甲双胍组差异不大，但相同环境下的空白组小鼠体重略有增长。各组小鼠中无死亡小鼠。

模型组小鼠的肝糖原含量明显降低。各组糖尿病小鼠的肝糖原值与正常组比较均有所降低。杨桃果汁中、高剂量组与模型组比较肝糖原含量显著升高（P＜0.01或 P＜0.05），低剂量组与模型组比较无显著性差异。

结果提示杨桃果汁中、高剂量组对小鼠糖尿病症状改善有一定作用。各组小鼠体重、肝糖原数据见表1。

表1 杨桃果汁对STZ所致糖尿病小鼠体重及肝糖原的影响（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

表1 杨桃果汁对STZ所致糖尿病小鼠体重及肝糖原的影响（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：与模型组相比较△P＜0.05表示显著，△△P＜0.01表示极显著。

组别样本/只初始体重/g 7 d体重/g 15 d体重/g肝糖原含量/（g/kg）空白 10 23.92±1.79 26.95±1.70 28.64±1.81 17.23±1.11模型 10 22.72±1.70 25.84±3.29 25.28±4.20 7.42±1.99二甲双胍 10 22.98±1.82 26.59±2.09 26.89±3.04 12.73± 1.86△△杨桃果汁低剂量 10 23.02±0.82 25.31±1.76 25.28±2.67 8.39±1.30杨桃果汁中剂量 10 24.80±1.12 26.81±1.95 26.65±2.50 9.21±1.06△杨桃果汁高剂量 10 24.13±1.06 25.79±2.32 26.21±3.45 11.31±1.65△△

2.2 杨桃果汁对糖尿病小鼠肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶（SOD）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、环磷酸腺苷（cAMP）的影响

STZ所致糖尿病各组小鼠肝组织较空白组中MDA、cAMP值有显著增高，SOD值显著降低，SDH含量有所降低。用药后，杨桃果汁低、中、高剂量组小鼠较模型组小鼠均能有效降低肝组织MDA值（P＜0.01或0.05），而中、高剂量组小鼠较模型组小鼠能相应增高SOD活力（P＜0.01）。杨桃果汁高剂量组较模型组能升高肝组织中SDH含量（P＜0.05）；能降低小鼠肝组织中cAMP含量（P＜0.05）。用药后虽提高了机体抗氧化能力，但与正常组比较仍有显著差异。具体数据见表2。

表2 杨桃果汁对STZ所致糖尿病小鼠肝组织MDA、SOD、SDH、cAMP的影响（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

表2 杨桃果汁对STZ所致糖尿病小鼠肝组织MDA、SOD、SDH、cAMP的影响（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：与模型组相比较△P＜0.05表示显著，△△P＜0.01表示极显著。

组别样本数/只肝组织MDA/（nmol/mgprot）肝组织SOD值/（U/mgprot）SDH含量/（μmol/L）cAMP含量/（nmol/L）空白 10 7.04±0.35 403.25±16.62 210.27±34.29 2.13±0.40模型 10 18.91±1.06 198.83±16.29 158.84±25.08 2.81±0.24二甲双胍 10 10.74±1.35△△ 350.74±19.49△△ 187.26±24.86△ 2.38±0.52△低剂量 10 17.39±1.79△ 214.85±22.30 163.31±27.34 2.77±0.34中剂量 10 16.18±1.21△△ 257.96±14.51△△ 171.80±24.61 2.65±0.31高剂量 10 12.88±1.87△△ 309.59±13.68△△ 183.17±27.65△ 2.48±0.32△

2.3 各组间小鼠胰岛细胞变化比较

肉眼观察：连续灌胃14天后取各组小鼠胰腺组织，空白组胰腺组织色淡红，分叶状，质软，无充血水肿等症状；模型组胰腺苍白，分叶状，质中，无明显肿大；给药各组无明显差异，胰腺组织色淡红，分叶状，质软，无明显肿大。

显微镜下观察：正常组胰岛由大小不等的细胞团构成，形态规则，与胰腺组织分界线清晰可见，胰岛细胞数量多，体积较大，分布饱满均匀；模型组胰岛细胞形态不规则，与胰腺组织分界线模糊，胰岛细胞数量明显减少，分布稀疏；二甲双胍组较模型组胰岛细胞规整，与胰腺组织分界线清楚，胰岛数量相对较多；杨桃果汁高、中、低剂量组较模型组胰岛细胞形态规则，与胰腺组织分界线清楚，其中杨桃中剂量组较之二甲双胍组胰岛形态无明显差别。

3 讨论

各组间小鼠的体重无明显差异，与2型糖尿病患者多以肥胖为特点不符[14]，可能由于小鼠患病时间短，且至今未获得与人类糖尿病完全一致的动物模型有关[15]，又或者与投喂非高脂饲料有关。肝糖原为一种葡萄糖聚合物以糖原的形式贮存在肝脏，机体内通过肝糖原的合成与消耗进行血糖调节。当血糖向肝糖原转化，导致血糖降低，肝糖原分解产生葡萄糖，血糖随之升高[16]。本研究造模组比空白组的肝糖原明显降低，与糖尿病患者肝糖原较正常人明显减少的报道相符[17]。

机体内氧化物的生成和清除出现失衡的一种状态称为氧化应激，是2型糖尿病发生发展的危险因素。作为测量氧化应激常用指标，MDA是脂类氧化的终产物，可加快糖尿病的发展[18]；SOD可清除氧自由基，减少对细胞的伤害，同时可修复氧自由基造成的细胞损伤[19]，而糖尿病可引起SOD活性降低，持久性高血糖可导致肝脏组织受损[20]。有报道糖尿病患者、糖尿病动物模型抗氧化能力受损，明显低于正常情况[21-22]，与本研究结果一致。

SDH是三羧酸循环的标志性关键酶，对糖的有氧氧化起着重要的调节作用[23]，通过提高其活性来降低血糖。cAMP是生命信息传递的“第二信使”，与胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌密切相关[24]。糖尿病本身可升高cAMP，且高血糖是升cAMP必要的辅助因素[25]，这与造模组较空白组cAMP明显提高相符。

胰岛细胞形态学结果表明STZ所致糖尿病小鼠的胰岛细胞存在一定损害。而杨桃果汁可以保护胰岛细胞，使其形态相对完整，从而增加胰岛素分泌，起到降血糖作用。

本实验研究结果发现，杨桃果汁通过推动糖尿病小鼠血糖向肝糖原合成、提高SDH活性以促进三羧酸循环、保护胰岛细胞，增加血糖利用来达到降糖作用。杨桃果汁还能提高肝组织SOD活性、降低MDA含量，通过改善高血糖致氧化应激异常对肝脏的损害，起到保护肝脏的作用。cAMP含量下降对杨桃果汁降糖有一定效果，具体作用机制还需进一步研究。

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