红小豆中总黄酮含量的不确定度评估

2018-05-15蔡玉红张之鑫宋志峰魏春雁

食品研究与开发 2018年9期

蔡玉红，张之鑫，宋志峰，魏春雁

（吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全风险评估实验室（长春），吉林长春130033）

红小豆（Phaseolus angularis Adzukibean），别名赤小豆、红豆、小豆，属于豆科一年生草本植物，原产于我国喜马拉雅山一带，属于高营养的杂粮，在我国各地广泛种植，有悠久的栽培历史[1]。随着检测水平的提高，医学研究的深入，红小豆在增进人们健康、体现“药食同源”的功能方面越来越为人们所了解。红小豆中的黄酮具有抗氧化功能，能够很好的消除人体内的氧自由基，可以有效的阻止细胞的衰老[2]。查阅文献得知，植物中总黄酮含量测定的方法有色谱法、紫外分光光度法[3]、分光光度法等[4]，常用的黄酮提取方法主要有超声波辅助提取法、乙醇浸提法、微波加热提取法[5]等，不同的测定和提取方法对黄酮含量测量结果有一定的影响。目前国际通用的检测报告要包含不确定度的评估，不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相关联的参数[6-8]。本文采用紫外分光光度法测定红小豆中黄酮含量，并对测量结果不确定度分量逐一评估，探讨了不确定度贡献率较高的分量产生原因，提出改进意见，降低合成不确定度总量。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

红小豆：市售；没有产地标签。

芦丁对照品：质量分数为99.2%，中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇、石油醚等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

T6新世纪紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BT124S电子天平：中国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；索氏提取器：上海那艾精密仪器有限公司；单标吸管、容量瓶：天津市天波玻璃仪器有限公司（A级）。

1.2 试样制备与测定

1）待测样品红小豆真空干燥恒重后，用高速旋转粉碎机研磨，通过40目筛，密封干燥备用。

2）准确称取样品3.0 g于索式提取器中（同时做8次重复），加入50mL石油醚溶液浸泡回流后[9-10]，倒出石油醚溶液，加入浓度70%乙醇溶液50mL浸泡回流，将合并提取液移入100mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容。用5mL移液管吸取4mL该溶液于25mL容量瓶中，依次加入70%乙醇溶液5mL、5%NaNO2溶液5mL、10%Al（NO3）3溶液3mL、8%NaOH溶液5mL，摇匀，最后用70%乙醇溶液定容至刻度。静置10min后在紫外分光光度计于510 nm波长处，测量试液的吸光度。代入回归方程计算，得出红小豆中总黄酮类化合物（以芦丁计）的含量（mg/mL）[11]。

1.3 标准溶液的配制

准确称取芦丁对照品6.5mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，既得0.064 5mg/mL系列芦丁储备液。

1.4 标准溶液工作曲线绘制

用10mL单线刻度吸管，分别吸取储备液0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，同1.2.2依次加入反应溶液摇匀定容，得到0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 系列浓度标准溶液。与待测液相同条件下，以70%乙醇溶液做参比，测量芦丁系列标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，绘制工作曲线，建立回归方程[12]。

2 不确定度分析

2.1 建立数学模型

试样中黄酮元素含量计算公式

式中：X为试样中黄酮的含量，mg/g；C为待测溶液中芦丁的浓度，mg/mL；V为试样定容体积，mL；m为试样取样量，g；f为溶液稀释倍数，25/4。

2.2 不确定度的来源

按照试验过程逐步筛选可能对检测结果产生影响的不确定度主要因素见图1，包括，（1）制备待测液引入的不确定度，包括天平、量具和环境条件；（2）标准工作曲线引入的不确定度，包括购买的标准溶液、配制系列标准溶液所用量具及实验员的熟练程度；（3）测定结果工作曲线拟合时引入的不确定度；（4）重复测定及仪器精密度引入的不确定度；（5）标物添加回收引入的不确定度；（6）操作人员的熟练程度和其他可能引入不确定度的因素均包含在扩展不确定度中。

图1 不确定度来源与分析Fig.1 The sourceof uncertainty and analysis

2.3 不确定度分量评定

2.3.1待测液制备过程引入的不确定度urel（X制）

待测液制备过程包括试样的称量、提取和显色定容3个步骤，期间使用了（0.1mg）天平、5mL移液管、25mL和100mL容量瓶。

2.3.1.1 试样称量引入的不确定度urel（X1）

万分之一天平的示值不确定度，天平的计量证书指出，称量误差为±0.2mg，按矩形分布计算，则示值不确定度；称量变动性（即称量重复性）引入的不确定度

称量带来的不确定度为0.115 5mg

称量带来的相对不确定度

2.3.1.2 试样提取、显色、稀释定容引入的不确定度urel（X2）

1）根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[13]规定计算，试样提取、显色、稀释定容所用到的容量器具引入的不确定度见表1。

2）试样提取用100mL的容量瓶定容，显色、稀释使用了5mL移液管和25mL容量瓶，该过程引入的相对不确定度计算如下：

表1 测定过程中容量器具引入的相对标准不确定度Tab le1 The relative standard uncertainty from glasscontainer during the determ ination

最终，待测液制备过程产生的不确定度为：

2.3.2 标准溶液引入的不确定度urel（X标）

标准溶液引入的不确定度包括购买的有证黄酮标准溶液及由此稀释配制系列标准溶液过程中引入的不确定度。

2.3.2.1 购买的芦丁标准品引入的不确定度urel（ρ1）

芦丁的纯度为99.2%，按均匀分布，则标准不确定度为

2.3.2.2 配制0.064 5mg/mL芦丁标准储备液引入的不确定度urel（ρ2）

1）称量6.5mg标准物质引入的相对标准不确定度

2）配制储备液使用100mL容量瓶1次，引入相对标准不确定度为

2.3.2.3 系列标准溶液配制的合成标准不确定度urel（ρ3）

配制系列浓度溶液用时分别使用10 mL吸管、25mL容量瓶各6次，由于在工作曲线的测量时平行测定3次，并设计了8次样品重复，在此，不再重复评定。

则标准溶液引入的合成相对标准不确定度为：

2.3.3 标准曲线拟合产生的不确定度urel（X拟）

参照标准曲线拟合产生的不确定度评定方法[14]，对本文标准溶液各点测定3次，取平均值，系列标准溶液浓度与吸光度检测结果及计算见表2。用最小二乘法进行拟合，建立直线方程y=10.65x+0.005；R2=0.999。

表2 标准曲线浓度－吸光度结果及计算Table2 The resultsand calculation of Standard solution concentration－fluorescence intensity

标准曲线拟合引入的不确定度为：

则标准曲线拟合引入的相对不确定度为：

2.3.4 重复性[14-16]、仪器精密度（稳定性）引入的不确定度urel（X重）

本方法从样品制备，提取显色反应步骤复杂繁琐，各环节的不确定度不易评定，可以通过样品重复性和仪器平行性测定，综合评定过程引入的不确定度分量。

准确称取3.0 g红小豆样品8份，同1.2.2方法提取制备待测液，每份待测液分取3次于紫外分光光度计上测定，样品重复性测定结果见表3。

表3 样品重复测定（总黄酮）结果Table3 Determ ination resultsof sam ple

被测溶液吸光度平均值：0.034，代入公式，试样中

样品重复性引入的不确定度：

样品重复性引入的相对不确定度：

样品中总黄酮的平均含量：7.08mg/g。RSD：1.326%；标准偏差：0.093 88mg/g。

2.3.5方法回收率引入的不确定度urel（X回）

实验中有黄酮提取不完全、显色干扰及量具转移损失等因素，需要测定方法的回收率[17]。根据样品测定结果等量添加对照品，按（1.2.2）制备待测液于紫外分光光度计上测定，计算结果回收率为96%～100%。

方法回收率引入的不确定度：

2.4 试样含量的合成标准不确定度

2.4.1 相对合成标准不确定度

相对合成标准不确定度为：

已知试样含量7.08mg/g，所以，试样含量的合成标准不确定度为：

2.5 扩展不确定度

2.6 检测结果

2.7 不确定度分量影响比较

各不确定度分量的评定和比较，结果见图2。

图2 不确定度分量贡献比较Fig.2 Comparison of contribution rate to theuncertainty component

3 讨论

1）试验采用Bottom-Up不确定度评定方法，方法精确，但计算繁琐也容易引起分量遗漏或重叠，要求评定人员仔细认真，既不遗漏也不重复。2）采用紫外分光光度法测定总黄酮含量时，以70%乙醇作为溶剂提取，提取完全简便。3）黄酮属于有机大分子成分，测定过程中，提取、显色及比色对测量结果影响较大，所以要通过评定准确度引入测量不确定度的量，判断测量方法、测量条件是否合适。4）由图2可知，最小二乘法拟和曲线引入的不确定度最高，可能是配制的标准曲线浓度范围较宽，实验中考虑初步判断黄酮含量之后，再用浓度接近，范围较窄的标准曲线进行测定。5）标准曲线配制和回收率引入的不确定度较高，对合成不确定度有一定的贡献，熟练的试验员改用精度较高的移液器可适量降低不确定度，样品制备引入的不确定度对测量结果影响不大，可以忽略。

参考文献：

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