正交试验优选马齿苋黄酮脱色工艺的研究

马骁，王飞飞，袁永雷，曲丽萍

（昆明贝泰妮生物科技有限公司，上海201702）

马齿苋为马齿苋科植物马齿苋（Portulaca oleracea L.）的全草，又称为“五行草”、“长命草”，在世界上的热带和亚热带地区都有较广泛的分布，我国除了高寒地区外，各地都有分布[1]。《本草经集注》记载马齿苋有清热解毒，散血消肿的效用，同时它也是我国卫生部划定的101种药食同源的野生植物之一，因此在国内外有着广泛的使用，是一种极具开发价值的绿色食品[2]。

马齿苋富含多酚类、黄酮类、生物碱类等化合物[3]，其中的黄酮类化合物具有很强的抗炎、抗氧化活性，可以降低血脂、降低血黏度、抑制动脉粥样硬化[4]，在食品、药品、化妆品等领域有着非常广泛的应用[2，5-6]，因此，国内外学者对马齿苋黄酮的提取工艺做了大量的研究[7-9]。不同产地的马齿苋黄酮成分含量差异明显，文献报道其含量在2%～12%之间[2，9-10]，然而该总黄酮颜色多为棕褐色，影响成品质量，限制了其在食品、化妆品等领域的应用，有必要进行脱色处理。活性炭作为一种常用脱色剂，具有污染小，吸附量大的特点[11]。因此，本文先通过大孔树脂富集马齿苋总黄酮部位，然后选用活性炭作为吸附剂，分别以脱色时间、脱色温度、活性炭用量为变量，设计正交试验，筛选适合马齿苋总黄酮的脱色工艺，并用建立的脱色工艺对3个产地的马齿苋进行提取脱色，比较脱色率和黄酮保留率的差异，为马齿苋总黄酮的进一步开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

R-100旋转蒸发仪：瑞士BUCHI；EA-2004分析天平：上海海康电子仪器；85-2磁力加热搅拌器：上海司乐仪器；Cary-60紫外-可见分光光度仪：美国Agilent；布氏漏斗：中国唐明陶瓷。

1.2 材料

马齿苋：产地分别为云南昆明、广西玉林、河南郑州、安徽亳州，经昆明植物研究所刘海洋研究员鉴定为马齿苋属植物马齿苋（Portulaca oleracea L.）；AB-8大孔树脂：沧州宝恩吸附材料公司；芦丁（纯度98.7%，批号Q2700050）：上海安谱科学仪器有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝及氢氧化钠均：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 马齿苋总黄酮的提取与精制

称取来自云南省昆明市的马齿苋200 g用1.6 L 60%乙醇回流提取两次，每次提取2 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏53.70 g，取浸膏10.24 g用AB-8大孔树脂进行总黄酮富集，先用水洗5个树脂柱体积（bed volume，BV）去掉非目标成分，然后40%乙醇洗脱8 BV，合并40%乙醇洗脱液，减压浓缩得马齿苋总黄酮1.80 g，得率为17.58%。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线绘制

参照文献[12]，用硝酸铝比色法对芦丁在500 nm下进行测定，得芦丁溶液在各浓度时的吸光度。以芦丁溶液浓度（y）对吸光度（x）做标准曲线，得到线性回归方程：y=0.744 8x-0.005，R2=0.999 3。

2.2.2 样品测定

分别精密称取马齿苋提取物100mg 3份，马齿苋总黄酮100mg3份，分别用20%乙醇水溶解于50mL容量瓶，作为供试品溶液。根据回归方程求出各供试品的总黄酮浓度，求出平均值，得到马齿苋提取物中总黄酮的含量为3.30%，马齿苋经AB-8大孔树脂纯化后总黄酮含量为7.13%。

2.3 单因素考察

选取脱色温度，脱色时间，活性炭用量作为考察因素，分别进行单因素试验，考察3个因素对脱色效果的影响。具体操作为取马齿苋总黄酮60mg，精密称定，用20%乙醇水溶液定容至15mL容量瓶中，溶液呈棕褐色，将其转移至25mL烧杯中进行脱色考察。按设计要求，加入适量的活性炭，并称取总量，在设定的温度中加热搅拌一定时间，用20%乙醇水溶液补齐重量，之后趁热过滤除去活性炭，收集滤液，各取1mL，用硝酸铝比色法对其在500 nm下测定吸光度，该吸光度与总黄酮含量成正比，吸光度越大总黄酮含量越高[12]。

2.3.1 黄酮保留率和脱色率的计算

用黄酮保留率和脱色率来评价活性炭的脱色效果，根据参考文献选取420 nm处的吸光度作为评价脱色效果的指标[13-14]，并按下面的公式对黄酮保留率和脱色率进行计算：

黄酮保留率=脱色后总黄酮含量/脱色前总黄酮含量×100%

脱色率=（脱色前吸光度-脱色后吸光度）/脱色前吸光度×100%

2.3.2 温度对脱色效果的影响

按 1%的活性炭加入量，设置 30、40、50、60、70 ℃5个脱色温度，用磁力搅拌器搅拌20min。过滤，比较各滤液颜色，结果显示颜色由深至浅依次为30℃棕色，40℃浅棕色，50℃浅棕色，60℃浅黄略棕色，70℃浅黄色。离心取上清，测定吸光度，结果见图1。

图1 不同脱色温度下的脱色效果Fig.1 Effectsof temperatureon decolorization

由图1可知，随着温度升高，脱色率上升，当温度升高至50℃时黄酮保留率最高，在之后有缓慢下降趋势，因此50℃左右是其较佳脱色温度。

2.3.3 时间对脱色效果的影响

按1%的活性炭加入量，设置温度为50℃，脱色时间分别为 10、20、40、50、60min，磁力搅拌器搅拌到各时间后，趁热过滤，比较各滤液颜色，结果显示，各颜色由深至浅依次为10 min浅棕色，20 min浅棕色，40 min浅黄略棕色，50min浅黄略棕色，60min浅黄色。离心取上清，测定吸光度，计算黄酮保留率及脱色率，结果见图2。

图2 不同脱色时间下的脱色效果Fig.2 Effectsof tim eon decolorization

由图2可知，脱色20min时，黄酮保留率及脱色率均较高，20min后黄酮保留率有下降趋势，因此较佳脱色时间应为20min左右。

2.3.4 活性炭用量对脱色效果的影响

设置温度为50℃，脱色时间为20min，活性炭使用量分别为0.5%、1%、1.5%，2%、3%，磁力搅拌器搅拌后过滤，比较各滤液颜色，结果显示，各颜色由深至浅依次为0.5%活性炭棕色，1%活性炭浅棕色，1.5%活性炭浅黄色，2%活性炭浅黄近无色，3%活性炭近无色。离心取上清，测定吸光度，计算黄酮保留率及脱色率，结果见图3。

图3 不同活性炭用量下的脱色效果Fig.3 Effectsofactive carbon on decolorization

由图3可知，随着活性炭用量的增加脱色率逐渐升高，但黄酮含量逐渐降低，综合考虑两者的重要性，确定1%左右的活性炭为较佳添加量。

2.4 正交试验

2.4.1 因素水平选择

根据单因素试验结果，选取三因素三水平进行正交试验。各因素的水平设计如表1。

表1 正交试验因素水平Tab le1 L9（34）orthogonal test design

2.4.2 正交试验及数据处理

将马齿苋总黄酮用20%乙醇水配制成4mg/mL的溶液，按表1所述正交试验方案进行试验。各脱色液过滤除去活性炭，比较滤液的颜色。离心取上清，测定吸光度，以黄酮保留率和脱色率为衡量脱色效果的考察指标，采用加权评分法对各脱色的效果进行评分[14]，权重系数均为0.5，分别把两个考察指标中的最大值定为100分，综合评分按下式进行计算，正交试验结果见表2、表3。

表2 直观分析表Tab le2 Analysisof L9（34）test results

表3 方差分析表Tab le3 Varianceanalysis

综合评分=（黄酮保留率/83.67%×100×0.5）+（脱色率/84.81%×100×0.5）

其中83.67%为黄酮保留率的最大值，84.81%为脱色率的最大值，由表2、表3可知，活性炭用量对脱色效果影响最为显著（P＜0.05），脱色温度和脱色时间影响较小。根据表2的k值结果得出马齿苋黄酮活性炭脱色的最佳工艺应为活性炭用量0.5%，脱色时间40min，脱色温度60℃。在此条件下进行试验发现脱色效果不如试验9中1%活性炭效果佳，结合产品研发对色泽的要求，最终选择最佳工艺为A3B3C2，即在60℃，加入1%活性炭，搅拌脱色40min，此时马齿苋黄酮保留率为57.11%，脱色率为79.19%。

2.4.3 验证试验

称取3份云南昆明的马齿苋黄酮各40mg，用20%乙醇水溶液定容至10mL容量瓶中，用选定的最佳脱色工艺进行脱色试验，脱色后的滤液呈浅黄色，脱色率均值为78.45%，相对偏差为1.74%，黄酮保留率均值为58.95%，相对偏差为1.35%，表明该最佳脱色工艺可行可靠。

2.4.4 不同产地马齿苋总黄酮脱色前后对比

选取来自广西玉林、安徽亳州、河南郑州的马齿苋，按2.1所述方法进行提取分离后，得到总黄酮浸膏，用选定的最佳脱色工艺进行脱色后，测定其黄酮保留率及脱色率，结果见表4。

表4 3个产地马齿苋总黄酮的活性炭脱色效果Table4 Effectsof decolorization of Portulaca oleracea L.in three areas %

由表4可知，3个产地的马齿苋总黄酮含量差异明显，脱色前安徽亳州的马齿苋黄酮含量最高，广西玉林的含量最低。用选定的方法进行脱色后，3个样品黄酮保留率均大于57%，3个样品脱色后颜色均显著变浅，脱色率均大于69%以上，表明本研究选定的最佳脱色工艺可以用于不同产地的马齿苋总黄酮脱色。

3 结论与讨论

马齿苋总黄酮被广泛使用在食品、药品、化妆品领域里[10]，然而因为其颜色较深，一定程度影响到成品的质量，给使用带来许多不便。在本研究中，正交试验数据分析的试验方案8所得的综合得分与选定的最佳工艺（试验方案9）得分相近，方案8和9在实际应用中侧重点会有所不同，在本文中，因方案8的脱色效果不够显著，颜色略深，故最终选定方案9为最佳脱色工艺，即在60℃，加入1%活性炭，搅拌脱色40min，此时的黄酮保留率为57.11%，脱色率为79.19%，经过3个批次样品的验证，脱色方案稳定、可靠。该方案在保留有效成分总黄酮的同时，尽可能脱去了颜色的干扰，有利于马齿苋进一步的开发应用。

本研究还用选定的最佳脱色条件考察了其它3个产地马齿苋总黄酮脱色前后的差异。结果显示，用选定的方案脱色后，3个产地的总黄酮保留率均大于57%，脱色率均大于69%，由于不同产地马齿苋所含成分存在差异，因此脱色效果也存在一定的差异。来自广西玉林和河南郑州的马齿苋脱色效果与云南马齿苋较一致，为浅黄色，安徽亳州的马齿苋总黄酮含量较高，脱色后颜色较其它两地的稍深，为浅黄棕色，亦达到预期要求，因此本研究的脱色工艺为不同产地马齿苋总黄酮的提取和脱色提供了方法和借鉴意义，同时为马齿苋总黄酮的纯化、深度挖掘和开发提供了一定的理论依据。

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