一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

杨署光 陈月异 李言 张世鑫 史敏晶

摘  要  研究植物体内H₂O₂的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法灵敏度高、特异性强、稳定性好，广泛用于植物H₂O₂测定，但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中，系统优化了Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的反应条件，并比较了丙酮提取法和TCA提取法对橡胶树萌条韧皮部H₂O₂的提取效果。结果表明，丙酮提取法稳定性差，TCA提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮H₂O₂的方法，为进一步研究橡胶树中H₂O₂的生理功能打下良好基础。

关键词  橡胶树;树皮;过氧化氢;测定中图分类号  S794.1      文献标识码  A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.009

活性氧（ROS）包括羟基自由基（HO×）、单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂^-）和过氧化氢（H₂O₂）几种形式^[1]，其中H₂O₂是相对稳定的一种活性氧。植物在生物/非生物胁迫下，活性氧产生过剩，从而激活各种胁迫信号转导途径加强植物对生物/非生物胁迫的抗性。研究表明，H₂O₂是一种有效的信号分子，在植物生长发育和胁迫反应中具有重要的生理功能^[2];H₂O₂是胁迫信号转导途径的中心成员，通过H₂O₂免疫能增强植物对非生物胁迫的抵抗能力^[3]。因此，研究植物体内H₂O₂的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。

最近研究发现，机械伤害诱导橡胶树萌条的次生乳管分化依赖H₂O₂^[4]。此外，割胶是天然橡胶生产的必需环节，也是橡胶树树皮遭遇的机械伤害。受伤的树皮组织中产生的H₂O₂对于伤口愈合可能有重要的调节作用。

Matsubara等^[5]在测定血清中自由脂肪酸（FFA）含量时建立了一种测定H₂O₂的Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂比色法，该方法灵敏度高、特异性强，被广泛用于植物内源H₂O₂含量测定。以此为基础报道了2种常用的植物H₂O₂提取测定方法：Patterson等^[6]报道的5%三氯乙酸（5%TCA）提取、活性炭（0.1 g/mL）脱色的Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法，以及吕波等^[7]、刘俊等^[8]报道的丙酮提取、萃取脱色的Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法。但在用Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法测定植物H₂O₂时，因植物种类和组织的不同，不同研究所用的植物H₂O₂样品制备方法和Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的反应条件不一致^{[5-6， 8-9]}。为此，本研究系统的探索了pH、温育时间、光照、过氧化氢酶（CAT）等因素对Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂复合物形成和吸光值的影响，评价了报道的2种植物H₂O₂常用提取方法（丙酮提取法和5% TCA提取法）对橡胶树萌条韧皮部H₂O₂的提取效果，以期建立一种简单、快速和重复性好的橡胶树树皮中H₂O₂含量的测定方法，为进一步研究橡胶树中H₂O₂的生理功能打下良好基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  巴西橡胶树无性系CATAS7- 33-97一年生萌条（3-5蓬叶），稳定期顶蓬的节间韧皮部。

1.1.2  主要试剂和仪器  所用试剂均为分析纯。其中TiCl₄溶液购自Sigma公司，4-（2-吡啶偶氮）-间苯二酚（PAR，4-（2-pyridylazo） resorcinol）購自上海生工，过氧化氢酶（CAT）购自Solarbio公司，HCl溶液、NaOH、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄等为国产分析纯。比色用分光光度计为BioMate 5（Thermo，America）。

1.2  方法

1.2.1  Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的条件优化  Ti（Ⅳ）-PAR试剂配制参照Matsubara等^[5]的方法，Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色反应体系参照刘俊等^[8]的方法：反应体系为3 mL，以H₂O为空白、3 mL Ti-PAR体系（H₂O 1 mL、0.2 mol/L PBS 1 mL、0.2 mmol/L Ti-PAR 1 mL）为对照、3 mL Ti-PAR- H₂O₂体系（H₂O₂1 mL、0.2 mol/L PBS 1 mL、0.2 mmol/L Ti-PAR 1 mL）为样品，测定508 nm处的吸光值（A_{508 nm}）。用对照与空白之间的ΔA_{508 nm}值代表Ti-PAR的吸光值，样品与对照之间的ΔA_{508 nm}值代表Ti-PAR-H₂O₂的吸光值。以1 mol/L Na₂HPO₄和1 mol/L NaH₂PO₄为母液，根据《分子克隆实验指南》^[10]中的方法配制出pH分别为6.0、7.0、7.4、7.8、8.0的0.2 mol/L PBS缓冲液。用NaOH调节pH为8.0的PBS缓冲液，分别配制pH为9.0、10.0、11.0、12.0的PBS缓冲液。用HCl调节pH为6.0的PBS缓冲液，配制pH为5.0的PBS缓冲液。以水为空白扫描300～ 600 nm的吸收光谱，确定PAR（0.031 25 mmol/L）、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光谱。

（1）0.2 mol/L PBS缓冲液的pH对PAR、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂复合物吸收光谱的影响。在不同的pH条件下建立0.05 μmol H₂O₂（1 mL 50 μmol/L H₂O₂）的比色体系，以水为空白扫描300～600 nm的吸收光谱，确定PAR（0.031 25 mmol/L）、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光谱。

（2）0.2 mol/L PBS缓冲液的pH对H₂O₂测定的影响。在不同的pH条件下建立0.05 μmol H₂O₂的比色体系，确定Ti-PAR-H₂O₂复合物形成的最适pH。

（3）45 ℃加热时间对Ti-PAR消除以及Ti-PAR-H₂O₂復合物的影响。建立pH 7.8和pH 12.0条件下0.05 μmol H₂O₂的比色体系，确定Ti-PAR-H₂O₂复合物形成以及Ti-PAR消除的最佳温育时间。

（4）Ti-PAR-H₂O₂复合物的检测限（LOD）、定量限（LOQ）分析。在pH 7.8条件下，建立0.05 μmol H₂O₂的比色体系（10次重复），从而得到10次结果的标准偏差（SD），参照Takanami等^[11]、Simth等^[12]的方法，分别用标准偏差的3倍和10倍表示检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

（5）Ti-PAR-H₂O₂复合物的光稳定性检验分析。在pH 7.8条件下，建立0.05 μmol H₂O₂的比色体系（10次重复），反应结束（记为0 h）后平分为2组，分别在室温避光和室温非避光条件下放置0、6、12、24 h后测定508 nm的吸光度，研究Ti-PAR-H₂O₂复合物的光稳定性和时间稳定性。

（6）Ti-PAR-H₂O₂法测定H₂O₂的标准曲线制作。在pH 7.8条件下，建立0.0～0.1 μmol H₂O₂的标准曲线，用于植物样本中H₂O₂的定量分析。

（7）过氧化氢酶（CAT）用量的确定。在pH 7.8条件下，在1 mL 100 μmol/L的标准H₂O₂（0.1 μmol H₂O₂）水溶液中加入不同量的CAT（0、10、20、30、40、50、60 μg，1 μg/μL），30 ℃消化10 min后建立比色体系，确定消化0.1 μmol H₂O₂所需的过氧化氢酶（CAT）量。

1.2.2  巴西橡胶树CATAS-7-33-97萌条树皮中H₂O₂的提取和含量测定  方法Ⅰ：丙酮提取、萃取脱色的Ti-PAR-H₂O₂比色法，采用吕波等^[7]、刘俊等^[8]的方法。在液氮下将样品研磨成粉，取0.2 g粉末，加3 mL冷丙酮充分混匀，冰上萃取10 min，期间间歇涡混3～4次;4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取1 mL丙酮提取物，加3 mL萃取剂（CCl₄∶CHCl₃=3∶1，V/V），混匀，再加入5 mL灭菌ddH₂O，立即涡混，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上层水相为H₂O₂待测液;各取1 mL待测液，一份作空白，加入50 ?L（1 ?g/?L）过氧化氢酶（CAT），30 ℃保温10 min;另一份待测液，加入50 ?L水;分别加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.8的PBS缓冲溶液和1 mL 0.2 mmol/L的Ti（Ⅳ）-PAR显色剂，室温反应10 min，45 ℃水浴20 min，冷却至室温，测508 nm的吸光值，根据ΔA_{508 nm}值计算H₂O₂含量。

方法Ⅱ：5% TCA提取的Ti-PAR-H₂O₂比色法。参照Patterson等^[6]、Zhou等^[13]的方法，本研究建立了不使用活性炭的5% TCA提取法^[4]。在液氮下将样品研磨成粉，取0.1 g粉末，加5 mL 5% TCA充分混匀，冰上萃取10 min，期间间歇涡混3～4次;4 ℃、12 000 r/min离心10 min;取上清1.5 mL，加1.5 mL 5% TCA稀释2倍，加等体积（3 mL）0.2 mol/L Na₂HPO₄（Sodium Phosphate，pH 12.6）溶液调节pH到8.0左右;4 ℃、12 000 r/min、离心10 min;各取2 mL待测液，一份作空白，加入50 ?L（1 ?g/?L）过氧化氢酶（CAT），30 ℃保温10 min;另一份待测液，加入50 ?L水;分别加入1 mL 0.2 mmol/L的Ti（Ⅳ）-PAR显色剂，室温反应10 min，45 ℃水浴20 min，冷却至室温，测508 nm的吸光值，根据ΔA_{508 nm}值计算H₂O₂的含量。

1.3  数据处理

用Excel 2003软件作图，利用SPSS?比较均值?单因素ANOVA?R-E-G-Q（Q）检验对结果进行差异显著性分析：标有不同大写字母者表示组间差异极显著（p<0.01），标有不同小写字母者表示组间差异显著（p<0.05）。

2  结果与分析

2.1  Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的条件优化

2.1.1  0.2 mol/L PBS緩冲液的pH对PAR、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂复合物吸收光谱的影响

结果表明，pH在5.0～11.0范围时，Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂复合物的吸收光谱一致，在此以pH 7.8的结果作代表，而pH 12.0的吸收光谱大不相同。由图1可以看出，PAR（图1-1）的最大吸收波长为413 nm，Ti-PAR（图1-4）的最大吸收波长为481 nm，Ti-PAR-H₂O₂（图1-3）的最大吸收波长为508 nm;当pH≤11.0时，45 ℃温育能消除多余的Ti-PAR，仅出现1个类似于PAR的吸收峰，从而消除Ti-PAR反应试剂对H₂O₂测定的干

扰（图1-2）;但当pH为12.0时，45 ℃温育未能完全消除多余的Ti-PAR，Ti-PAR在508 nm处仍有很强的吸收，强烈干扰H₂O₂测定（图1-4），从而导致Ti-PAR-H₂O₂的最大吸收波长提前到500 nm，测定结果偏高（图1-5）。结果表明，在合适的pH条件下，加热能充分消除多余Ti-PAR对测定结果的干扰。

2.1.2  0.2 mol/L PBS缓冲液的pH对H₂O₂测定的影响  由图2-A的结果可以看出，pH<11.0时，对照的吸光度低，表明Ti-PAR对测定结果的干扰小;pH>11.0时，对照的吸光度升高，表明Ti-PAR对测定结果的干扰大;pH<7.0时，H₂O₂的测定结果偏低，pH为7.0～11.0时，H₂O₂的测定结果相对稳定并且在pH为7.4～8.0时测定结果最高;pH>11.0时，H₂O₂的测定结果偏低;pH>11.0时，随着Ti-PAR干扰的增加，反应体系的吸光度随之增加。pH为7.4、7.8、8.0时对照、样品以及它们之间的差值差异不显著，重复性好。因此Ti- PAR-H₂O₂法的最适pH为7.4～8.0。在植物材料H₂O₂测定中本研究采用的pH为7.8。

2.1.3  加热时间对Ti-PAR消除以及Ti-PAR-H₂O₂复合物的影响  将反应体系室温反应10 min后，在45 ℃下温育不同时间。结果表明，pH为7.8时（图2-B），反应体系中加入Ti-PAR后，多余的Ti-PAR很快消除，室温10 min就能消除大部分多余的Ti-PAR，并且45 ℃温育5 min就足以消除多余的Ti-PAR，使对照反应获得稳定的较低的吸光度;而pH为12（图2-C）时，反应体系中

加入Ti-PAR后，虽然对照反应很快就获得稳定的吸光度，但仍然保持很高的水平，是pH 7.8时的6倍以上，并且延长加热时间到620 min也无法消除Ti-PAR对H₂O₂测定的干扰，说明在强碱性条件下Ti-PAR比较稳定（与图2-A的结果一致）。另一方面，不同的温育时间之间Ti-PAR-H₂O₂三元复合物的吸光度差异不大，说明Ti-PAR-H₂O₂三元复合物形成速度快并且具有优良的温度稳定性。温育的作用一方面是消除多余Ti-PAR对测定结果的干扰，另一方面是促进Ti-PAR-H₂O₂三元复合物的显色反应。因此在植物材料H₂O₂测定中本研究采用的是室温反应10 min，45 ℃、20 min，使H₂O₂完全形成Ti-PAR-H₂O₂三元复合物。

2.1.4  Ti-PAR-H₂O₂复合物的检测限（LOD）、定量限（LOQ）检验分析  用本方法测定H₂O₂，吸光值A_{508 nm}的LOD和LOQ的值分别为0.020和0.066，H₂O₂浓度的LOD和LOQ的值分别为1.6 μmol/L和5.3 μmol/L。

2.1.5  Ti-PAR-H₂O₂复合物的光稳定性检验分析  图2-D的结果表明，每个时间点中蔽光与否的结果均无显著差异，说明Ti-PAR-H₂O₂复合物在光线下具有良好的稳定性;蔽光条件下各时间点间的结果无显著差异，非蔽光条件下各时间点间的结果也几乎无显著差异（虽然放置24 h的结果与0 h的结果达到0.05的显著水平，但差异很小），说明Ti-PAR-H₂O₂复合物在24 h内保持稳定。

2.1.6  Ti-PAR-H₂O₂法测定H₂O₂的标准曲线制作  标准曲线方程为y=12.528x，R²=0.998 7（图2-E），其中y表示A_{508 nm}的吸光值，x表示H₂O₂的量（单位μmol）。

2.1.7  过氧化氢酶（CAT）用量的确定  图2-F的结果表明，随着CAT用量增加，ΔA_{508 nm}的值减少;CAT用量从30 μg增加到60 μg，测定结果无差异，表明30 μg CAT就能完全消化1 mL 100 μmol/L标准H₂O₂水溶液中的H₂O₂（含量为0.1 μmol，ΔA_{508 nm}为1.236±0.0081）。在植物材料H₂O₂测定中，以加入CAT消化的样品为对照，将未加CAT的反应体系的A_{508 nm}控制在1.0以内，因此体系中的CAT用量30 μg已足够，为了保证对照体系中的H₂O₂被CAT完全消化，实际反應时加入的CAT量为50 μg。

2.2  巴西橡胶树CATAS-7-33-97萌条韧皮部中H₂O₂的提取和含量测定

本研究用2种方法测定了巴西橡胶树CATAS- 7-33-97萌条韧皮部的H₂O₂含量（图3）。结果表明，方法Ⅰ得到的样品待测液（萃取后的上层水相）在508 nm处的吸光值几乎为零，而有机相（萃取剂）在508 nm处的吸光值为0.416 7，说明萃取能有效去除色素，用此方法测得萌条韧皮部的H₂O₂含量为1.86 ?mol/g（鲜重）左右，但随着提取时间延长到3 d，该方法几乎测不到H₂O₂含量，说明此方法的稳定性不好，丙酮不能完全抑制橡胶树树皮中的CAT酶活性;方法Ⅱ得到的样品待测液（5% TCA提取相）在508 nm处的吸光值也很低，说明用5% TCA为提取液，经过本文的制备流程，样品中几乎没有色素的干扰，用此方法测得萌条韧皮部的H₂O₂含量为3.99 ?mol/g（鲜重）左右，并且随着提取时间延长到3 d，H₂O₂含量几乎不变，说明此方法的稳定性好，5% TCA能完全抑制橡胶树树皮中的CAT酶活性。

3  讨论

3.1  生物体中H₂O₂含量测定的分光光度法

H₂O₂含量测定的分光光度法主要有3种。第一种是Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法^{[6， 14-16]}：H₂O₂与Ti（Ⅳ）离子在碱性条件下形成Ti（Ⅳ）-H₂O₂沉淀，溶于5%硫酸后在410 nm处有最大的光吸收;经丙酮提取、Ti（Ⅳ）沉淀H₂O₂、丙酮洗涤脱色，测得正常条件下黄瓜子叶H₂O₂含量差异大，为0.75～ 6.82 ?mol/g（鲜重）^[15-16]。第二种是醌亚胺比色法^{[13， 17]}：H₂O₂在过氧化物酶的作用下与4-氨酰安替比林和苯酚反应生成稳定的红色产物醌亚胺，在505 nm处有最大的光吸收^[17];经5% TCA提取、0.15 g活性炭脱色，测得8种植物叶片H₂O₂为0.2～0.8 ?mol/g（鲜重）^[13]。第三种是Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂比色法^[5-6]：H₂O₂与Ti（Ⅳ）-PAR反应形成三元复合物，在508 nm处有最大的光吸收^[5];经5% TCA提取、0.7 g活性炭脱色，测得5种植物叶片中H₂O₂为0.1～0.6 ?mol/g（鲜重）^[6]，经丙酮提取、萃取脱色，测得5种植物葉片H₂O₂为0.1～0.8 ?mol/g（鲜重）^[7-8]。

Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的灵敏度约是醌亚胺比色法的5倍^[5]、Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法的38.5倍^[7]。Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法的特异性最差，标准的Ti（Ⅳ）-H₂O₂复合物的吸收光谱是以410 nm为中心的峰，而测定植物叶片提取物中H₂O₂时没有获得类似的吸收峰，认为吸光度A₄₁₀大部分来自色素等干扰物质^[6]，对小麦叶片的研究表明，96.8%的A₄₁₀来自背景和色素^[7]，因此，此方法大都过高估计叶片中的H₂O₂水平;醌亚胺比色法的颜色形成需要过氧化物酶，已知过氧化物酶促进色原体如4-氨酰安替比林-苯酚和其他还原性物质如抗坏血酸等的氧化，由于过氧化物酶的不完全选择性，还原性物质如抗坏血酸通过H₂O₂明显抑制色原体颜色的形成，显著降低H₂O₂的回收率^{[13， 17]};Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂法通过Ti（Ⅳ）-PAR试剂的颜色形成不需要过氧化物酶，因此，吸光度几乎不受还原性物质如抗坏血酸的影响^[5]。醌亚胺的光吸收在反应起始后5～20 min内保持稳定^[13];Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂复合物在反应起始后的几分钟内就能获得稳定的吸光值，在室温下可保持稳定超过24 h^[5]。

Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的灵敏度、特异性、稳定性都最好。本文系统地探索了该方法的反应条件。结果表明，PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光谱与Matsubara等^[5]报道的一致，但Ti-PAR的吸收光谱（A_max481 nm）与Matsubara等^[5]报道的（A_max523 nm）有一定差异;Ti-PAR-H₂O₂颜色形成最适pH为7.4～11.0，与Matsubara等^[5]报道的7.6～ 12.0有些微差异;安钰^[9]要求在蔽光条件下保存反应产物Ti-PAR-H₂O₂复合物，本研究表明Ti-PAR-H₂O₂复合物在正常条件下很稳定，不需要刻意蔽光保存;Ti-PAR-H₂O₂复合物在24 h内保持稳定，与Matsubara等^[5]报道的一致;Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂复合物具有很好的光稳定性和温度稳定性。

3.2  植物样本中H₂O₂的提取（制备）方法

活体植物材料中含有高水平的过氧化氢酶、过氧化物酶活性，抑制这些酶活性是H₂O₂提取的重要环节，有机溶剂丙酮作为提取剂能抑制酶活性，但后续反应中不能应用CAT。TCA作为水相提取剂能变性酶类，能应用CAT，对比色反应影响小，H₂O₂的回收率高^[6]。去除干扰物质是精确测定H₂O₂的又一个前提，色素和还原性物质是H₂O₂测定的主要干扰因素，丙酮洗涤脱色^{[6-7， 14-16]}、活性炭脱色^{[6， 13]}和萃取脱色^[7-8]是目前去除色素的主要手段。丙酮洗涤脱色主要与丙酮提取、Ti（Ⅳ）-H₂O₂沉淀法配合使用。当用酸性Ti（Ⅳ）试剂处理时，深绿色的植物提取物变成茶褐色，用丙酮或其他溶剂洗涤脱色失败，此法获得的A₄₁₀大部分来自色素和背景干扰物^{[5， 7]};活性炭既能去除色素、还原性物质如抗坏血酸等干扰物，提高H₂O₂的稳定性^[13]，又能强烈吸附H₂O₂，降低H₂O₂的回收率^{[7-8， 13]}。在丙酮提取法中，吕波等^[7]、刘俊等^[8]报道了一种以CCl₄/CHCl₃（3∶1，V/V）为萃取剂的萃取脱色法，能有效去除样品中的色素，H₂O₂的回收率在95%～99%，在后续比色反应中还可应用CAT制备对照。

本研究结果表明，丙酮不能有效抑制橡胶树树皮中的CAT活性，不适合用作橡胶树树皮H₂O₂的提取剂，蔡甫格^[18]的研究也表明，直接用丙酮提取橡膠树胶乳中的H₂O₂，测定结果重复性不好、准确性不高。用于植物叶片H₂O₂提取的TCA法，常用活性炭来吸附色素^{[6， 13]}，但活性炭也能大量吸附H₂O₂^{[7-8， 13]}，降低H₂O₂回收率，影响测定结果的准确性。本研究结果还表明，直接用TCA提取橡胶树树皮中的H₂O₂，几乎提取不到色素，也避免了使用活性炭对H₂O₂的吸附，结果稳定性好;用方法Ⅱ成功检测到不同处理条件下橡胶树萌条韧皮部H₂O₂水平的差异^[4]。在橡胶树树皮中，方法Ⅱ优于方法Ⅰ，与小麦叶片^[7-8]中的表现相反;用5% TCA提取、0.15 g活性炭脱色、醌亚胺比色法成功检测到柱花草叶片中的H₂O₂，而用5% TCA提取、0.1 g活性炭和0.1% PVPP脱色、Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法失败^[13]。以上结果表明，不同类型的植物材料所适合的H₂O₂提取、纯化和测定方法可能不同。

3.3  H₂O₂和CAT在酸性条件下的稳定性

研究表明，双氧水（H₂O₂）在pH<3.5的强酸性条件才稳定^[19]，酸性环境（pH<5.0）对双氧水的催化分解有明显的抑制作用^[20-22];生物体中的CAT不耐酸，在酸性环境稳定性差、活性低^[23-27];因此在CAT活性测定中常采用强酸终止反应^{[24，26， 28-29]}。这是本研究用5% TCA（pH<1.0）提取H₂O₂的优点之一，既保证了H₂O₂的稳定性又抑制了CAT活性。

4  结论

本文建立了一种简单、快速、有效的适合橡胶树稳定期萌条树皮中H₂O₂的测定方法：5% TCA提取，Ti-PAR-H₂O₂（pH=7.8，室温反应10 min，45 ℃温育20 min）比色法。用酸性的5% TCA作为提取液，既保证了H₂O₂的稳定性又抑制了样本中的CAT活性，5% TCA对样品中的色素几乎无提取能力，因此不需要活性炭脱色，从而避免了活性炭对H₂O₂的吸附。Ti-PAR-H₂O₂复合物颜色形成的最适pH为7.4～11.0，考虑到测定植物样品H₂O₂时对照需要CAT消化H₂O₂，为了保证加入的CAT活性，建议反应体系的pH为7.4～8.0;Ti- PAR-H₂O₂复合物形成快速、特异且稳定，保证了测定结果的可靠性和重复性。橡胶树萌条树皮（绿色）中含有大量的色素，因此本研究建立的方法适用于橡胶树树皮和叶片H₂O₂含量测定，但是否适用于橡胶树胶乳中H₂O₂含量测定尚不清楚。

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