海南与国外香荚兰质构特性及挥发性成分差异性分析
2018-05-14霍建文张筠徐飞张彦军初众
霍建文 张筠 徐飞 张彦军 初众
摘 要 采用穿刺法分析海南（Hainan，HI）、巴布亚新几内亚（Papua New Guinea，PNG）、马达加斯加（Madagascar，MG）香荚兰质构特性差异，利用电子鼻结合顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术对HI与PNG、MG香荚兰挥发性成分进行分析比较。质构特性结果显示：表皮韧性大小关系为HI < PNG、MG，PNG与MG差异不显著（p>0.05）；表皮硬度表现为HI、MG 关键词 香荚兰；质构特性；挥发性成分；电子鼻；顶空固相微萃取气质联用 中图分类号 TQ654.2 文献标识码 A Abstract The puncture method was used to analyze the differences in the texture characteristics among Hainan （HI）， Papua New Guinea （PNG） and Madagascar （MG）. The electronic nose coupled with headspace solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） was used to analyze the aroma components of vanilla from HI， PNG and MG. The results indicated that the toughness of the epidermis for HI was lower than that of PNG and MG. PNG and MG were not significantly different （p>0.05）. The skin hardness for HI and MG was lower than that of PNG， HI and MG showed no significant difference （p>0.05）. Internal hardness and firmness of vanilla were shown as HI< MG< PNG. A total of 74 aroma components were identified from the three kinds of vanilla pods through HS-SPME-GC-MS. 45， 50 and 51 of which were detected in PNG， HI and MG of vanilla pods. The main content of vanillin in HI vanilla was 69.11%， slightly lower than that of PNG （75.15%） and MG （74.36%）. Low content and more aroma of the substance with guaiacol， 4-methyl guaiacol and 4-methyl phenol were detected. The relative contents of HI and PNG and MG were different. In addition， 8 kinds of volatile compounds were found in HI， including formic acid， 2-ethylfuran， 2，4，5-trimethyloxazole， 2，3，5，6-tetramethylpyrazine， 1，2-dimethoxybenzene， Damascone， vanillic acid and palmitic acid. Key words vanilla； texture； aroma components； electronic nose； headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.025 香荚兰（Vanilla planifolia Andrews），又名香果兰、香草兰，属热带藤本植物，原产于墨西哥[1]，20世纪60年代引入我国，主要种植在海南一带；新鲜的绿色豆荚并不具有其特征香气，需要经过杀青、发酵、干燥、调理4个阶段产生一系列酶促及非酶促反应，最终产生迷人的香气[2]；因此被广泛应用于食品、高级烟酒、香水及制药等领域[3]。除此之外，香荚兰还具有抗氧化、抗癌、降血脂、抑菌等生物活性[4]。 近年来，国内外学者对香荚兰的研究较深入，大多集中于对风味物质的研究报道。Klimes等[5]在香荚兰原荚中共检出了170多种挥发性成分，其中香草醛被认为是最主要的呈香物质；董智哲等[6]采用固相微萃取和同时蒸餾萃取两种方法收集香荚兰豆荚中挥发性成分，结果表明固相微萃取适合检测小分子易挥发的物质，而同时蒸馏萃取侧重于检测极性较弱、水溶性较差的大分子物质，2种方法联合使用可更全面地萃取香气成分；初众等[7]将香荚兰的整荚和皮中的香气成分进行比较研究，结果表明香荚兰整荚中的大部分挥发性成分在香荚兰皮中均有检测到，且含量及种类较为接近；李智等[8]研究发现不同等级的香荚兰中挥发性成分差异明显，3个等级的香荚兰中芳香族化合物含量最高；香草醛、香草酸等主要呈香物质含量不会随豆荚等级的升高而增加。前人虽然已对香荚兰风味物质进行了大量的研究，但有关海南与国外香荚兰的系统比较研究未见报道。因此，本研究采用穿刺法对海南与巴布亚新几内亚、马达加斯加香荚兰质构特性差异性进行分析，同时采用HS-SPME-GC-MS结合电子鼻对豆荚中挥发性成分进行鉴别，探究本土豆荚与国外豆荚挥发性香气成分上的区别，进一步明晰海南香荚兰的特征香气，为海南香荚兰的有效利用及产品研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
HI香荚兰（产自海南，单元式热空气生香法发酵，含水率26.85%）、PNG香荚兰（产自巴布亚新几内亚，塔希提生香法发酵，含水率19.33%）、MG香荚兰（产自马达加斯加，波旁生香法发酵，含水率22.16%）由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。
TA-XT plus质构分析仪（英国stable micro system公司）；电子鼻分析系统（法国Alpha M.O.S公司）；CAR/PDMS（75um）固相微萃取头（美国Supelco公司）；7890A-5975C高效气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）。
1.2 方法
1.2.1 质构特性分析 采用质构分析仪对香荚兰进行TPA（Texture profile analysis）分析，穿刺探头采用P2N不锈钢针型探头，测试在（26±4）℃的温度环境下进行。主要仪器设定参数为：测前速度0.5 mm/s，测试速度0.5 mm/s，测后速度10 mm/s，应变80%，负载触发力10 g，数据采集率500 pps。
1.2.2 电子鼻测试条件 称取1 g样品均匀装入10 mL样品瓶中，加蓋密封；电子鼻系统配备有5套金属传感器，各传感器性能见表1[9]；G6500-CTC自动进样器，载气为净化空气；流速150 mL/min；孵化温度50 ℃；孵化期300 s；注射器温度60 ℃；注射体积1500 μL；数据采集延迟时间180 s；采集时间90 s；
样品平行4次。
1.2.3 HS-SPME条件 参照董智哲等[6]的方法略作改动，称取1 g香荚兰粉末，置于15 mL固相萃取瓶中，加盖密封，将其放入80 ℃恒温孵化器预热20 min，再将CAR/PDMS（75μm）纤维头插入固相萃取瓶中吸附 20 min， GC-MS进样口解吸附8 min。
1.2.4 GC-MS条件 色谱柱为DB-5MS毛细管柱
（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，1.5 ℃/min的速率升温至65 ℃，保持2 min，再以0.5 ℃/min的速率升温至70 ℃，再以5 ℃/min升温至90 ℃，再以3 ℃/min升温至170 ℃，最后以4 ℃/min的速率升温至220 ℃并保持2 min；载气为超纯氦，流速1 mL/min，不分流进样。
质谱条件：电子电离源；离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃；连接口温度250 ℃；电子能量70 eV；电子倍增电压1 200 V；扫描方式为全扫描；质量扫描范围m/z 30～300 amu。
1.3 数据处理
质构数据采用SPSS 20.0软件统计分析，Origin 8.0软件作图；电子鼻数据采用仪器自带软件Alpha Soft V 12.0处理，Origin 8.0软件作图；GC-MS分析按照GC-MS谱库（NIST 14，Mainlib， Replib）进行检索并参考有关文献定性鉴定检出成分，与谱库中化合物相似度低于80%的组分标为未鉴定出，通过峰面积归一化法确定其相对质量分数。
2 结果与分析
2.1 质构特性分析
香荚兰质构特性分析指香荚兰在外力的作用下，使其发生形变所需要的力。对香荚兰进行穿刺试验，以穿刺过程中时间为横坐标，测试探头所处时间的触发力为纵坐标作图，得到不同产地香荚兰质构穿刺受力曲线见图1。
从HI样品的穿刺曲线（图1-a）可以看到质构针形探头从荚果表皮插入内部的受力全过程，探头接触荚果表皮时力逐渐增加，首先在3.5 s左右产生第一个峰，表皮发生破裂，峰力值分布在200～400 g之间；破裂之后力值会有短暂的减小，此时开始感应内部力值的变化，伴随探头深入，香荚兰内部感应力值逐渐增大最终达到150～250 g之间。图1-b为PNG特征曲线，与图1-a分布规律不同，第一个峰峰力值分布在350～500 g之间，且峰出现时间相对于图1-a有所提前，内部感应力值最终达500～700 g之间。图1-c为MG香荚兰特征曲线，在第一个峰峰力值与峰出现时间上与图1-a相似，但豆荚内部感应力值与图1-a和图1-b不同，最终范围分布在400～600 g之间。根据针形探头穿刺香荚兰过程受力曲线的出峰时间及受力值分布规律的不同，反应出3种香荚兰在质地结构上是有所区别的，但此分析只能作为简单直观的数据，不能确切地进行比较分析，因此需要对穿刺曲线分析程序（Macro）进行编辑获得确切参数，以便更透彻的分析香荚兰的质构特性[10]。
在孙锐等[11]、赵登超等[12]、马庆华等[13]、Shiu等[14]研究基础上结合香荚兰自身特点分3个阶段对穿刺曲线进行解析定义，香荚兰质构穿刺曲线定义如图2所示。在测试开始的第一阶段，探头接触荚果表皮时，受力值逐渐增加，此时0～1 s（纵坐标轴与锚1之间）的陡升值（斜率），可反映豆荚的韧性（g/sec），在达到第一峰力值时，荚果表皮发生破裂，此时的峰力值表达果荚的表皮硬度（g），第二阶段穿刺荚果内部，其对应曲线上45%～85%（锚2与锚3之间）的平均力表示内部硬度，最后阶段针形探头从豆荚中拔出，由于荚果包裹产生负力作用，此时曲线最大负峰力值与穿刺深度比值表达香荚兰的紧实度（g/mm）。
曲线经解析后得到数据见表2，对香荚兰受力的第一阶段分析可知，表皮韧性的大小关系为HI
香荚兰的生香是一个十分复杂的过程，挥发性成分含量和种类会由于种植地区不同而存在差异。Gassenmeier等[28]采用高效液相色谱技术对MG、PNG等来源于7个不同国家的90多组香荚兰样本中的主要香气成分—香草醛的绝对含量进行检测，发现不同国家香荚兰样本中的香草醛含量各不相同，其中MG香荚兰中香草醛平均含量为1.78 g/hg，PNG为1.34 g/hg。目前，我国海南发酵的香荚兰中香草醛的绝对含量可以达到3 g/hg[29]。其次，加工工艺上的区别同样影响着香气成分的生成。Pardio等[30]研究7种不同杀青工艺条件下处理的豆荚，经发酵生香3个月后，豆荚内所含有的香草醛、对羟基苯甲醛、香草醇等风味化合物的含量存在差异；江明等[31]研究不同加工条件下与香荚兰香气成分转化相关内源酶的变化规律时发现，杀青及发酵的温度和时间极大影响着豆荚中内源酶活性损失程度，继而影响着豆荚整个生香过程中挥发性香气成分的转化。目前，我国主要采用单元式热空气加工法生香，巴布亚新几内亚和马达加斯加分别采用塔希提法和波旁法生香，3种加工工艺技术条件上的区别（如杀青、发酵温度和时间及方式等）是我国香荚兰与国外香荚兰在香气成分上存在差异的重要因素。
3 讨论
采用穿刺法对HI与PNG、MG香荚兰的质构特性进行分析，结果显示，在表皮韧性、表皮硬度、内部硬度、紧实度上，HI均表现出小于PNG、MG的趋势；采用电子鼻结合HP-SPME-GC-MS对挥发性成分进行分析，通过电子鼻PCA可以将HI与PNG、MG香荚兰进行区分；GC-MS共检出74种挥发性成分，主要呈香物质香草醛的含量在HI香荚兰中略低于PNG和MG；检出的香气较为强烈物质如愈创木酚、4-甲基愈创木酚等在3种豆荚中的相对含量均存在一定差异。此外，在HI香荚兰中鉴定出8种特有挥发性成分，其中4种具有芳香气味，分别是香草酸、2-乙基呋喃、2，4，5-三甲基唑、2，3，5，6-四甲基吡嗪。各地区气候环境、土壤环境及加工工艺的不同对香荚兰等植物类的挥发性香气成分的生成均有着极大的影响，刘晔等[32]对庐山云雾茶的挥发性成分进行研究，发现不同地区所产云雾茶的主要特征香气成分含量各不相同。郭胜男等[33]利用HS-SPME-GC-MS分析了不同产地肉桂的挥发性成分，发现广西产肉桂与其余产地差异较大，挥发性成分的种类更多；周斌等[34]比较了不同国家不同烘焙工艺下咖啡的香气成分，发现不同样品中香气成分种类相似，但含量差别较大。
本研究通过电子鼻结合HP-SPME-GC-MS对我国同国外香荚兰挥发性成分进行分析，进一步明晰了海南香荚兰的特征香气；同时采用质构仪对香荚兰质构特性进行分析，以更全面地反映海南香荚兰同国外香荚兰的差异，为海南香荚兰的开发利用及研究提供重要参考。在后续工作中，有必要对香荚兰生长及加工过程中主要香气成分及其前体物质之间的转化形成机制进行研究，探讨影响香荚兰挥发性成分的关键因素，提高香荚兰的风味品质。
参考文献
[1] Gallage N J， Mller B L. Vanillin-bioconversion and bioengineering of the most popular plant flavor and its de novo biosynthesis in the vanilla orchid[J]. Molecular Plant， 2015， 8（1）： 40-57.
[2] Odoux E， Grisoni M. Vanilla[M]. Boca Raton： CRC Press， 2011： 173-175.
[3] Baqueiro-Pe?a I， Guerrero-Beltrán J ?. Vanilla （Vanilla planifolia Andr.）， its residues and other industrial by-products for recovering high value flavor molecules： A review[J]. Journal of Applied Research on Medicinal & Aromatic Plants， 2017， 6： 1-9.
[4] Bythrow J D. Vanilla as a medicinal plant[J]. Seminars in Integrative Medicine， 2005， 3（4）： 129-131.
[5] Klimes I， Lamparsky D. Vanilla volatiles--a comprehensive analysis[J]. International Flavours & Food Additives， 1976， 7：272-291.
[6] 董智哲， 谷風林， 徐 飞， 等. 固相微萃取和同时蒸馏萃取法分析海南香草兰挥发性成分[J]. 食品科学， 2014， 35（2）： 158-163.
[7] 初 众， 王海茹， 张彦军， 等. HS-SPME-GC-MS技术分析香草兰果皮的挥发性成分[J]. 食品科学， 2016， 37（6）： 126-131.
[8] 李 智， 初 众， 姚 晶， 等. 海南产不同等级香草兰豆挥发性成分分析[J]. 食品科学， 2015， 36（18）： 97-102.
[9] Qin Z， Pang X， Chen D， et al. Evaluation of Chinese tea by the electronic nose and gas chromatography–mass spectrometry： Correlation with sensory properties and classification according to grade level[J]. Food Research International， 2013， 53（2）： 864-874.
[10] 张翔宇， 李喜宏， 王妍丹， 等. 基于果形和穿刺测试的葡萄浆果质构特性分析[J]. 食品工业科技， 2017（1）： 338-343
[11] 孙 锐， 孙 蕾， 马金辉， 等. 各品种不同成熟度无花果质构特性分析[J]. 食品与机械， 2017， 33（2）： 22-25.
[12] 赵登超， 贾 明， 唐贵敏， 等. 质构穿刺检测石榴籽粒质地品质[J]. 热带作物学报， 2016， 37（7）： 1 419-1 423.
[13] 马庆华， 王贵禧， 梁丽松. 质构仪穿刺试验检测冬枣质地品质方法的建立[J]. 中国农业科学， 2011， 44（6）： 1 210-1 217.
[14] Shiu J W， Slaughter D C， Boyden L E， et al. Effect of the shear-to-compressive force ratio in puncture tests quantifying watermelon mechanical properties[J]. Journal of Food Engineering， 2015， 150： 125-131.
[15] 刘明池， 小岛孝之， 田中宗浩， 等. 草莓果实含水量对品质的影响[J]. 华北农学报， 2002， 17（3）： 114-117.
[16] 帅希祥， 梁瑞红， 张红卫， 等. 水分含量对南酸枣糕质构和色泽的影响[J]. 食品与机械， 2012， 28（6）： 12-15.
[17] 陈 拉， 林 电. 香草兰营养特性的研究[J]. 热带作物学报， 1998， 19（2）： 55-64.
[18] 陈善娜， 梁 斌， 周恒苍， 等. 两种遮荫对香荚兰生理生长的影响[C]//中国植物生理学会. 中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编. 杭州. 2003： 1.
[19] 彭永彬， 李 玉， 徐鹏程， 等. 葡萄果实硬度及影响硬度的主要因素[J]. 浙江农业学报， 2014， 26（5）： 1 227-1 234.
[20] Kiani S， Minaei S， Ghasemi-Varnamkhasti M. Application of electronic nose systems for assessing quality of medicinal and aromatic plant products： A review[J]. Journal of Applied Research on Medicinal & Aromatic Plants， 2016， 3（1）： 1-9.
[21] Gómez A H， Wang J， Hu G， et al. Electronic nose technique potential monitoring mandarin maturity[J]. Sensors & Actuators B Chemical， 2006， 113（1）： 347-353.
[22] 宋 偉， 刘 璐， 支永海， 等. 电子鼻判别不同储藏条件下糙米品质的研究[J]. 食品科学， 2010， 31（24）： 360-365.
[23] 马 辉， 王亚超， 马永昆， 等. 基于主成分分析法分析超高压处理对黄瓜水香气的影响[J]. 现代食品科技， 2014（3）： 220-226.
[24] 郑福平， 宁洪良， 郑景洲， 等. 电子鼻对花椒精油的辨别研究[J]. 食品科学技术学报， 2010， 28（4）： 9-15.
[25] Brunschwig C， Sengeremonnot P， Aubanel M L， et al. Odor-active compounds of Tahitian vanilla flavor[J]. Food Research International， 2012， 46（1）： 148-157.
[26] Perezsilva A， Odoux E， Brat P， et al. GC-MS and GC-olfactometry analysis of aroma compounds in a representative organic aroma extract from cured vanilla （Vanilla planifolia G. Jackson） beans[J]. Food Chemistry， 2006， 99（4）： 728-735.
[27] Cicchetti E， Chaintreau A. Comparison of extraction techniques and modeling of accelerated solvent extraction for the authentication of natural vanilla flavors[J]. Journal of Separation Science， 2009， 32（11）： 1 957-1 964.
[28] Gassenmeier K， Riesen B， Magyar B. Commercial quality and analytical parameters of cured vanilla beans （Vanilla planifolia） from different origins from the 2006–2007 crop[J]. Flavour & Fragrance Journal， 2008， 23（3）： 194-201.
[29] 陈庆文， 郭运青. 海南香草兰产业发展概况[J]. 热带农业科学， 2010， 30（7）： 61-64.
[30] Pardio V T， Mariezcurrena M D， Waliszewski K N， et al. Effects of killing conditions of vanilla （Vanilla planifolia， Andrews） pods during the curing process on aroma composition of pod ethanol extract[J]. International Journal of Food Science & Technology， 2009， 44（12）： 2 417-2 423.
[31] 江 明， 刘 涛， 杨祖武， 等. 不同加工处理条件下香荚兰荚果中二种内源酶的活性变化[J]. 植物分类与资源学报， 2005， 27（3）： 310-314.
[32] 刘 晔， 王远兴， 葛丽琴. 三个产地不同等级庐山云雾茶挥发性成分主成分分析[J]. 食品科学， 2017[2018-04-25]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20170927.1448.090.html.
[33] 郭胜男， 卢金清， 蔡君龙， 等. HS-SPME-GC-MS联用分析不同产地肉桂挥发性成分[J]. 中国调味品， 2014（12）： 113-117.
[34] 周 斌， 任洪涛. 不同产地咖啡豆香气成分分析[J]. 食品研究与开发， 2016， 37（2）： 128-132.
