牛骨酶解物对制备牛肉香精中挥发性风味成分的影响

成晓瑜+李迎楠+刘文营+贾晓云

摘 要：以牛肉香精为研究对象，从挥发性风味物质组成和电子鼻分析角度研究不同牛骨酶解物添加量对其风味品质的影响。结果表明：不同牛骨酶解物添加量使牛肉香精在风味物质方面有较大的差异性。牛骨酶解物添加量为6 g时，牛肉香精中挥发性物质含量较高，达到95.39%，其中具有特征风味的吡嗪类、醛类、酮类化合物的含量相对较高；运用电子鼻技术分析发现，除添加量为8 g和10 g时有部分重叠，其余条件下样品存在显著性差异。在此条件下得到的牛肉香精烤香味较为明显，具有良好的风味香气。

关键词：牛肉香精；风味物质；牛骨酶解物；电子鼻；固相微萃取-气相色谱-质谱

Effect of Addition of Enzymatic Hydrolysate of Bovine Bone into Maillard Reaction System on Volatile Aroma Composition of Beef Essence

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， JIA Xiaoyun

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China）

Abstract： This study was intended to examine the effect of adding different amounts of bovine bone collagen hydrolysate prepared with flavourzyme to the Maillard reaction system used to produce beef essence on the flavor quality of reaction products. The results showed that the volatile flavor compounds of beef essence varied significantly depending on the amount of added bovine bone collagen hydrolysate. The addition of 6 g of bovine bone collagen hydrolysate led to the generation of high amounts of volatile compounds （95.39%） in the beef essence， with the characteristic flavor compounds pyrazines， aldehydes and ketones being dominant. Electronic nose analysis suggested that the flavor compounds formed in the presence of 8 and 10 g of the hydrolysate were partly identical， and significant differences were found at other addition levels of the hydrolysate. The beef essence obtained under this condition had an outstanding roast aroma and good flavor.

Key words： beef essence； flavor substances； bovine bone collagen hydrolysates； electronic nose； solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （SPME-GC-MS）

中图分类号：TS251.94 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）04-0001-05

DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001

引文格式：

成晓瑜， 李迎楠， 刘文营， 等. 牛骨酶解物对制备牛肉香精中挥发性风味成分的影响[J]. 肉类研究， 2016， 30（4）： 1-5. DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

CHENG Xiaoyu， LI Yingnan， liu Wenying， et al. Effect of addition of enzymatic hydrolysate of bovine bone into maillard reaction system on volatile aroma composition of beef essence[J]. Meat Research， 2016， 30（4）： 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI： 10.15922/j.cnki.rlyj.2016.04.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

还原糖的羰基和游离氨基间的美拉德反应与食品风味之间的关系，为美拉德反应制备肉味香精奠定了基础[1]。美拉德反应获得的肉类风味物质能够比较逼真地让人感受到肉香气的浓郁和口味的厚重，吸引了大量的学者研究，也成为咸式香精市场的宠儿[2]。

氨基作为美拉德反应的重要前提物质，它的来源对反应十分重要。近年来研究发现不同来源蛋白质、多肽或氨基酸提供的氨基对反应产物风味物质的形成影响很大。Eric等[3]研究发现向葵粕多肽美拉德反应产物可作为增香剂；Ogasawara等[4]研究发现1 000～5 000 D的多肽是增强反应产物风味、鲜味及持续性的关键；Liu等[5]研究发现不同种类的蛋白质或多肽通过美拉德反应可增强加工过程中的风味；Huang[6]、綦艳梅[2]等对大豆、牛肉等水解产物、半胱氨酸对反应物挥发性风味物质的影响进行了分析。而屠宰副产物牛骨的蛋白质十分丰富，其酶解液含有不同分子质量的多肽以及氨基酸[7]，可作为美拉德反应制备牛肉香精的重要氨基来源。

目前，国内外研究多集中于以肉蛋白为来源的酶解产物对反应物风味的影响[8-9]，以牛骨酶解产物的相关研究较少。因此，增加牛骨在肉味香精方面的开发，对副产物的综合利用具有更深远的意义。实验中采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、电子鼻风味分析方法，研究不同牛骨酶解物添加量对牛肉香精主要挥发性成分的影响，为牛骨在牛肉香精的开发应用提供理论技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肉、牛骨购于北京丰台牛街清真市场。

复合动物蛋白酶、风味蛋白酶 诺维信（中国）投资有限公司；木糖、半胱氨酸、丙氨酸等均为食品级。

1.2 仪器与设备

SUPELCO固相微萃取 美国Sigma公司；TRACE 1310气相色谱-TSQ8000质谱联用仪 美国Thermo公司；PEN3型便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；LGJ-30D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉酶解物、牛骨酶解物制备

参考文献[7]方法，取牛骨破碎后加热至110 ℃，取下层骨渣酶解，酶解温度为60 ℃，复合动物蛋白酶15 mg/g，酶解4 h，风味蛋白酶10 mg/g，酶解2 h后终止反应；将酶解液冻干后备用。

称取新鲜牛肉，按肉水比1∶1（m/m）加入水，经组织捣碎机搅碎，加入0.4%风味蛋白酶，50 ℃酶解4 h后终止反应，冷却至室温备用。

1.3.2 美拉德反应制备牛肉香精

准确称量并添加牛肉酶解物50 g、木糖5 g、葡萄糖2 g、酵母1 g、半胱氨酸5 g、牛油5 g、水解植物蛋白液（hydrolyzed vegetable protein，HVP）30 g、丙氨酸1.5 g、甘氨酸3 g，分别添加牛骨酶解物2、4、6、8、10 g，混合均匀，美拉德反应时间为75 min，反应温度为105 ℃，考察不同牛骨酶解物添加量对牛肉香精风味的影响。

1.3.3 GC-MS测定

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）：取1 mL牛肉香精样品装入顶空瓶中，50 ℃水浴锅中平衡30 min，将事先250 ℃条件下老化30 min的固相微萃取针头插入顶空瓶中，吸附30 min。吸附结束后，将萃取针头插入气相色谱进样口，在250 ℃条件下解析5 min，进行GC-MS测定[10-11]。

色谱条件：色谱柱DB-Wax极性柱；流速1.0 mL/min。程序升温：进样口温度250 ℃，起始柱温35 ℃保持3 min，以5 ℃/min升温到200 ℃，再以10 ℃/min升到250 ℃保持5 min。质谱条件：传输线温度260 ℃；离子源温度280 ℃；质谱质量扫描范围设定为40～600 u。

1.3.4 电子鼻传感器检测

PEN3型电子鼻传感器的不同金属氧化物半导体型化学传感元件对应的敏感物质类型不同[12]。不同来源的氨基得到的美拉德反应产物不同，进而影响挥发性风味物质的种类和含量，因此在传感器上呈现不同的气味感应信号。

准确量取1 mL牛肉香精，25 ℃恒温环境平衡2 h，运用电子鼻传感器对不同样品进行检测，传感型号在60 s后基本稳定，选定信号采集时间为70 s。

1.4 数据处理

风味组分的质谱分析：检索NIST11.L和Demo.l数据库，对不同条件下牛肉香精的挥发性组分进行定性分析，并根据面积归一化法求得各成分的相对百分含量。

电子鼻分析数据分析：运用Winmuster软件对数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 结果与分析

2.1 SPME-GC-MS测定分析结果

在牛肉香精的热反应体系中，添加不同牛骨酶解物2、4、6、8、10 g分别得到牛肉味的反应物，采用SPME方法，结合GC-MS，对挥发性风味成分进行分析，得到的总离子流图如图1所示，鉴定出的挥发性风味成分见表2。

由表2可知，在牛骨酶解物添加量2、4、6、8、10 g时制备的牛肉香精经GC-MS分别检出37、36、43、43、42 种挥发性风味成分，主要是醇类、醛类、酮类、酯类、含氮类、酸类等，其种类及相对含量见表3。主要包括：糠醇、2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、3-甲基-2-丁酮、

2-甲基四氢呋喃-3-酮、3-甲基-1，2-环戊二酮、乙酸异丙烯酯、γ-戊内脂、2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、

2-乙酰基吡咯、愈创木酚等，这些化合物挥发性成分含量较高，不同牛骨酶解物添加量制备的产物挥发性风味物质的总量由高到低依次为6 g>8 g>10 g>4 g>2 g。

醇类化合物是由羰基化合物还原或脂肪经氧化分解产生的。在反应体系中醇类较其他类别相对含量最高，主要为糠醇，糠醇具有焦糖香、甜香及咖啡香等气味[7]，4 种反应物含量均在25%以上，10 g的牛骨酶解物添加量的相对含量最高，高达36.96%。Wettsinghe等[13]研究发现不饱和醇阈值较低，具有蘑菇香味，对肉品风味的形成具有一定的作用。

含氮类的化合物总量列居第2位，种类也最多。含氮类化合物是肉品最重要的香味呈味物[14]，其中吡嗪类化合物是挥发性风味成分中的重要组分，在反应体系中含量最高。吡嗪是美拉德反应所产生的主要挥发性物质之一，这些芳香成分已被确认为烧烤香的直接贡献化合物[1]。不同牛骨酶解物添加量的反应产物中均含有2-乙基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙酰基吡咯、2，5-二甲基-3-丙基吡嗪，它们提供烧烤牛肉的风味。相对含量较高的2，3，5-三甲基吡嗪具有坚果香、

可可及土豆样香气；2-乙酰基吡咯具有蔬菜、蘑菇及土豆香气[7]。牛骨酶解物添加量为6 g时，牛肉香精中含氮类化合物含量相对较高，达到18.24%，其中吡嗪类化合物含量为14.04%；而添加量为4 g和8 g时吡嗪类化合物含量较低，添加量为2 g时吡嗪类化合物种类虽较高，但整体风味物质含量较少，且香味不够浓郁。因此牛骨酶解物添加量为6 g时牛肉香精烤香味较为明显，具有良好的风味香气。

醛、酮类化合物属于羰基类化合物，在检测出的挥发性风味化合物中，羰基类化合物对牛肉香精特征风味的形成具有重要作用，不同肉香风味的差异主要来自于羰基化合物的定性定量差异[15]。醛、酮类化合物可以增强牛肉香精的层次感，使其风味更加圆润[16]。牛骨酶解物添加量的不同，对牛肉香精中醛、酮类化合物含量影响较大，其中添加量为6 g时，牛肉香精中羰基类化合物含量较高，达到29.48%，且种类较多，其次为添加量为8 g时含量为26.99%，而添加量为2 g时羰基化合物含量最低。醛类化合物的阈值较低[17]，能够赋予牛肉香精清香、果香及坚果香，其中含量相对较高的2-甲基丁醛具有果香及坚果香，苯甲醛可能赋予产物脂香风味。而酮类化合物多具有甜香味，其中3-羟基-2-丁酮具有甜香，2-甲基四氢呋喃-3-酮具有果香及青香，5-甲基-2-乙酰基呋喃具有烤香、烟熏香及清甜的气味[18]。

酸类化合物可能是由相应的醇、醛在美拉德反应过程中高温氧化得到的。牛骨酶解物添加量为4、10 g时含量较高，其中含量相对较高的乙酸呈现刺激、尖酸的气息，对牛肉香精的风味有一定的影响，其余条件下酸类化合物含量相差不大。酯类化合物主要是游离的脂肪酸和脂肪氧化产生的醇酯化产生的，内酯和硫酯对肉味香精有一定的贡献。其中添加量为6 g时，牛肉香精中酯类化合物含量较高，达到5.39%，且种类达8 种，其中相对含量较高的乙酸酯类具有愉快的水果香气；而γ-戊内酯具有果香及甜香。酯类化合物在挥发性风味物质中所占比例相对较少。醚类、酚类化合物检测出的相对较少，二糠基醚具有咖啡、榛子、坚果香气，而愈创木酚具有可口的肉香及烟熏味[18]。

综合上述分析得到，牛骨酶解物添加量为6 g时，牛肉香精中挥发性物质含量较高，其中具有特征风味的吡嗪类化合物及醛、酮类化合物的含量相对较高。可认为，在该反应条件下牛肉香精中牛骨酶解物添加量为6 g较为适宜。

2.2 电子鼻测定结果

利用电子鼻技术从整体香气成分水平上对不同牛骨酶解物添加量条件下牛肉香精进行主成分分析和线性判别分析。PCA转换中得到的贡献率越大，则主要成分可以更好地反映多指标信息[19-20]。由图2A可知，PC1、PC2的方差贡献率分别为88.22%和9.10%，总贡献率为97.32%，说明其主成分可以很好地反映指标信息，除添加量为8 g和10 g条件下有部分重叠，其余数据点均分布在各自的区域内，说明不同牛骨酶解物添加量下肉味香精的主成分之间有显著性差异，添加量为4 g时，数据点与其他距离较大，说明添加量为4 g与其他条件主成分有明显差异。由图2B可知，LD1、LD2的方差贡献率分别为78.77%和8.67%，总贡献率为87.44%，其中添加量为8 g和10 g时有部分重叠，说明二者之间具有一定的相似性，其余数据分布较为分散。因此，采用PCA和LDA分析方法，能够区分出这5 种添加量下样品间存在显著性差异，风味均有所改变。

图 2 不同牛骨酶解物添加量肉味香精的PCA分析（A）和LDA分析（B）

Fig.2 PCA analysis （A） and LDA analysis （B） of beef essences produced with different amounts of bovine bone collagen hydrolysate

3 结 论

不同添加量牛骨酶解物的牛肉香精在挥发性风味物质方面有较大的差异性，可见牛骨酶解物含量对牛肉香精的风味品质有很大的影响。通过SPME-GC-MS对挥发性组分进行定性、定量分析结果显示，牛骨酶解物添加量为6 g时，牛肉香精中挥发性物质含量较高，达到95.39%，其中具有特征风味的吡嗪类化合物及醛、酮类化合物的含量相对较高；运用电子鼻技术分析发现，除添加量为8 g和10 g时有部分重叠，其余条件下样品存在显著性差异。在此条件下得到的牛肉香精烤香味较为明显，具有良好的风味香气。

本研究同时添加牛肉酶解物及牛骨酶解物发生美拉德反应，同时对产物风味品质进行分析，判断出较为适宜的牛骨酶解物添加量，同时得到风味较好的牛肉香精，为牛肉香精的研发提供一定的理论参考。

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