绿豆核酸酶的提取及活力测定

胡敏

摘要 [目的]优化绿豆核酸酶的提取条件并测定其活力。[方法]利用单因素和正交试验，考察提取时间、料液比、pH、芽长几个因素对从绿豆芽中提取核酸酶的影响，优选出各影响因素的最佳水平，并进行活力测定。[结果]提取时间20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽长是绿豆长的4倍时，绿豆核酸酶酶活最高为478.86 U/ mL 。影响绿豆核酸酶提取的因素主次顺序依次为提取时间、pH、料液比、芽长。采用饱和度为80%的硫酸铵盐析沉淀后，酶活达 1 569.6 U/ mL ，较提纯前提高了2.28倍。[结论]该研究可为核酸酶的开发利用提供参考。

关键词 绿豆；核酸酶；提取；活力

中图分类号 S522 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0149-03

Abstract [Objective]To optimize the extraction conditions of mung bean nuclease and determine its vitality.[Method]Single factor and orthogonal experiments were used to investigate the effects of extraction time，material to liquid ratio，pH and bud length on the extraction of nuclease from mung bean sprouts.The best level of each influencing factor was selected and the activity was determined.[Result]The extraction time was 20 h，the solidliquid ratio was 1∶12（g∶mL），pH 3，and the bud length was 4 times the length of mung bean，and the maximum activity of the mung bean nuclease enzyme was 478.86 U/ mL.The main and secondary factors affecting the extraction of mung bean nuclease are extraction time，pH，ratio of material and liquid，and length of bud.After precipitation of ammonium sulfate with saturation of 80%，the enzyme activity reached 1 569.6 U/ mL，which was 2.28 times higher than that before purification.[Conclusion]This study can provide reference for the development and utilization of nuclease.

Key words Mung bean； Nuclease； Extraction； Activity

核酸酶作用于核酸链中的磷酸二酯键。不同来源的核酸酶，可能具有不同的分子结构和催化性能[1-2]。核酸酶可以从毒蛇的毒汁、绿豆芽、麦芽根中提取得到，也可以利用桔青霉生產。

绿豆核酸酶是来源于绿豆芽的5′-磷酸二酯酶，可将单链DNA水解为5′端带磷酸基团的单核苷酸或寡核苷酸[3]。双链DNA、双链RNA及DNA与RNA杂交链对此酶相对不敏感，但此酶量大时也能将双链核酸完全降解。作用的最适pH为5.2～5.4[4]，最适温度37 ℃，需要Zn2+、乙二胺四乙酸（EDTA）为抑制剂，0.01%十二烷基磺酸钠（SDS）（pH 5.0）能够使酶完全失活[5]。

目前，核酸酶可用作食品添加剂、生化药物，在农业上可作为植物生长剂[6]，在饲料上用作高效安全的添加剂[7]，也可用于各种调味品[8]、功能性食物、核酸强化食品、保健品的生产[9]。采用磷酸二酯酶水解RNA法生产5′-核苷酸是目前核苷酸生产的主要方法。从世界整体情况来看，核苷酸总体上供不应求，在全球范围内属于紧缺产品，市场前景良好。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：绿豆。主要仪器：752N紫外可见分光光度计、PDZ5-WS低速自动平衡离心机、HHS型电热恒温水浴锅、PHS-25型数显酸度计。主要试剂：硫酸铵、醋酸钠、醋酸、氯化钠、硫酸锌、甘油、高氯酸、大肠杆菌菌液、裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇、RNaseA、ddH2O。

1.2 方法

1.2.1 绿豆预处理。称取绿豆200 g，清洗5遍装入烧杯中，用5层纱布覆盖，加入25 ℃温水浸泡。每2 h淋一次水，待豆芽长到要求长度取出待用[10]。

1.2.2 底物DNA的制备。取1.5 mL大肠杆菌菌液，离心，弃上清，加入40 μL裂解液，37 ℃水浴30 min。加入132 μL氯化钠，离心，取上清置新离心管中。加入300 μL苯酚和300 μL氯仿，混匀，离心，取上清置新离心管中。加入600 μL氯仿，离心，取上清置新离心管中。加入800 μL无水乙醇，-20 ℃静置10 min，离心，弃上清。加入300 μL 70%乙醇清洗，晾干，加入2 μL RNaseA、30 μL ddH2O，使用浓度纯度分析仪在波长260 nm处测定底物DNA浓度。置于4 ℃冰箱备用[11-12]。底物也可选用长春花基因组DNA。

1.2.3 单因素试验。

1.2.3.1 提取时间对绿豆核酸酶提取的影响。

取绿豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液（含0.1 mol ZnSO4），分别提取4、8、12、16、20、24、28、32 h。过滤弃滤渣，滤液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min离心取上清，分别测定其核酸酶活力。

1.2.3.2 料液比对绿豆核酸酶提取的影响。

取绿豆芽4 g，在冰上研磨分别加入8、16、24、32、40、48、56、64 mL的0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液（含0.1 mol ZnSO4），使料液比分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16（g/mL）。过滤弃滤渣，滤液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min离心取上清，分别测定其核酸酶活力。

1.2.3.3 pH对绿豆核酸酶提取的影响。

取绿豆芽4 g，在冰上研磨分别加入pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液（含0.1 mol ZnSO4）。过滤弃滤渣，滤液65 ℃水浴15 min，3 500 r/min离心取上清，分别测定其核酸酶活力。

1.2.3.4

芽长对绿豆核酸酶提取的影响。分别取芽长为绿豆长度1、2、3、4、5、6、7、8倍的绿豆芽4 g，在冰上研磨加入0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液（含0.1 mol ZnSO4）。过滤弃滤渣，滤液65 ℃水浴15 min，离心取上清，分别测定其核酸酶活力。

1.2.4 绿豆核酸酶活力的测定。

取甲乙2支2 mL离心管，分别加入稀释5倍、浓度为1.8 μg/mL的底物DNA 50 μL和pH 5.0的0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液40 μL，于65 ℃水浴中预热10 min，然后在甲管中加入10 μL酶液，继续保温10 min。甲乙两管再分别加入高氯酸溶液（2.5%）100 μL[13-14]，乙管补加10 μL酶液，冷却放置15 min，3 500 r/min离心15 min，取上清。在波长260 nm处测OD260。以先加高氯酸的离心管为对照，在上述条件下，每1 min形成的核苷酸能使波长260 nm处的光密度差为1.0的量，定义为1个酶活单位。计算公式如下：

酶活力=（OD260甲-OD260乙）×1.8/10 （1）

1.2.5 正交试验。通过对料液比、提取时间、pH、芽长单因素的研究，选择4个合适的水平，进行4因素4水平的正交试验。

1.2.6 绿豆核酸酶粗酶液的提纯。

1.2.6.1 硫酸铵分级沉淀。取2 mL正交试验最优组合的粗酶液分别加入8 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸铵溶液，静置48 h。

1.2.6.2 透析。将盐析溶液加入透析袋中，流水透析48 h，3 500 r/min离心取上清，测定核酸酶活力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对绿豆核酸酶提取效果的影响。

由图1可知，在提取20 h之前，随着提取时间的延长，提取液中绿豆核酸酶酶活不断提高；在提取20 h时达到最大值，酶活为293.76 U/mL；在20 h之后继续延长提取时间，提取液中的绿豆核酸酶酶活逐渐下降。原因为提取20 h之前是豆芽中的绿豆核酸酶不断被提取到提取液中的过程，提取液中酶浓度不断增高使酶活增高；在提取20 h时绿豆芽中绝大多数的绿豆核酸酶被提取出来；再延长提取时间导致绿豆核酸酶在提取环境下存留时间过长引起部分酶活降低或者失活。

2.1.2 料液比对绿豆核酸酶提取效果的影响。

由图2可知，在料液比1∶2～1∶8（g∶mL）時酶活力变化不明显，1∶8～1∶12（g∶mL）时有明显增长，1∶12～1∶16（g∶mL）时有小幅下降，其中在料液比为1∶12（g∶mL）时达到最大值，酶活为281.34 U/mL。原因为过大的料液比会稀释酶的浓度，使单位体积提取液中酶活降低；而过低的料液比会导致绿豆核酸酶从绿豆芽中提取到缓冲溶液的速度缓慢。

2.1.3 pH对绿豆核酸酶提取的影响。由图3可知，在其他提取条件相同时，用pH 4.0的0.2 mol/L醋酸钠缓冲溶液提取时，酶活达到最大值，为273.42 U/ mL；酸度过高时酶活有一定幅度的下降，当pH大于4.0时酶活有明显下降。说明过酸和过碱的提取环境都会造成酶活力的下降。

2.1.4 芽长对绿豆核酸酶提取的影响。

由图 4可知，绿豆芽长为绿豆5倍长时酶活力达到最大值，为293.40 U/mL；当绿豆芽长小于绿豆5倍长时，随着长度的增加酶活逐渐增加；在绿豆芽长大于绿豆5倍芽长时，随着芽长的增加酶活逐渐降低。

2.2 正交试验

绿豆核酸酶提取的正交试验因素水平设计见表1，结果见表2。正交试验结果显示，影响绿豆核酸酶提取因素的主次顺序依次为提取时间、pH、料液比、芽长，由k值分析得出的最优组合为A3B3C2D2，由表2的直观分析得出最优组合为A3B3C1D2。综合考虑，选取A3B3C1D2为最优组合，即提取时间20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽长为绿豆长的4倍，此条件下绿豆核酸酶酶活为478.86 U/ mL。

2.3 绿豆核酸酶粗酶的提纯

由图5可知，在硫酸铵饱和度为80%时提纯效果最好，酶活为1 569.6 U/mL ，酶活力较提纯前提高了2.28倍。

3 结论

该试验以绿豆为材料，以绿豆核酸酶酶活为考察指标，在以提取时间为单因素的试验中提取时间为20 h时，酶活最高为293.76 U/mL；在以料液比为单因素的试验中料液比为1∶12（g∶mL）时，酶活最高为281.34 U/mL；在以pH为单因素的试验中pH 4.0时，酶活最高为273.42 U/mL；在以芽长为单因素的试验中芽长为绿豆的5倍长时，酶活最高为293.40 U/mL。通过正交试验结果分析得出最佳提取条件为提取时间20 h，料液比1∶12（g∶mL），pH 3.0，芽长为绿豆的4倍长，在最佳条件下得绿豆核酸酶粗酶液的酶活为478.86 U/mL。

在硫酸铵分级沉淀试验中，采用饱和度为80%的硫酸铵提纯效果最好。绿豆核酸酶酶活为1 569.6 U/mL ，酶活力较提纯前提高了2.28倍。

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